基于生物信息学miR-221调控前列腺癌分子机制的研究

张世昌 郑 江

长江大学附属第一医院，湖北省荆州市 434000

前列腺癌(Prostate cancer,PCa)具有高度激素敏感性, 是男性泌尿系统常见的恶性肿瘤，发生骨转移和复发的概率较高, 患者预后不良，前列腺癌的发病率和死亡率正逐年升高[1]。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类长度约为22个核苷酸(nt)的非编码RNA,miRNA可通过与靶mRNA的3’端非翻译区(3’-UTR)互补配对,在转录后水平调控基因的表达, 导致mRNA的降解或翻译抑制[2], 通过参与细胞增殖、凋亡等多种生理过程，对疾病发挥重要的调节作用，与多种肿瘤的发生关系密切[3]。有研究表明[4],miR-221可以调控前列腺癌细胞的凋亡、生长、侵袭等多种生物过程，可能与其激活JAK/STAT信号通路有关，说明miR-221与前列腺癌的发生关系密切。

GEO数据库[5]是物种基因表达的在线数据库。本研究在GEO数据库获得了数据集GSE45627[4]，该数据集包括两种样本，一是过表达的miR-221前列腺癌细胞样本，二是正常表达miR-221的前列腺癌细胞样本。通过对这两个样本数据的分析和比较，得到miR-221调控前列腺癌的重要靶点。对基因进行功能富集分析、蛋白—蛋白质互作(PPI)网络和模块分析。本研究结果可以为以后的基础实验提供可靠的作用靶点基因。

1 材料和方法

1.1 基因芯片数据 GSE45627基因表达数据来源于GEO数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)，研究类型为expression profiling by array，在GPL570平台上表达(Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array)。GSE45627数据集为前列腺癌细胞，物种是人，其中过表达miR-221前列腺癌细胞2例(n=2)，正常表达miR-221的前列腺癌细胞2例(n=2)。

1.2 识别DEG 利用Morpheus软件(https://software.broadinstitute.org/morpheus/)制作热图对基因芯片数据进行分析，观察基因表达的情况。利用在线分析工具GEO2R[6]对表达的差异基因进行分析和筛选，筛选的条件为P<0.01和|log2FC|≥1。利用Graphpad Prism软件制作火山图，观察筛选的差异基因。

1.3 差异基因功能和通路富集分析 用DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)进行差异基因的注释。基因功能富集包括分子功能和生物过程以及细胞组分。信号通路的富集分析主要是用到KEGG数据库，KEGG(http://www.genome.jp/)是一个包含KEGG信号通路的数据库，用于检查基因簇的路径和相关功能。

1.4 PPI网络的建立和模块的分析 利用String[7]数据库(http://www.string-db.org/)的检索工具可以检索已知和预测的蛋白质之间的关联，并且通常用于预测分子生物学中的PPI信息。将差异基因导入String数据库，得到差异基因相互作用的数据。Cytoscape3.5.0(http://www.cytoscape.org/)用于显示差异基因互作关系的结果。对PPI网络的结果进行了模块分析，采用了与Cytoscape相关的Mcode聚类算法进行模块分析，模块分析可以用来识别更多的连接基因群。

2 结果

2.1 筛选基因结果 用Morpheus软件制作的热图观察所有基因的表达情况，如图1所示。并且鉴定了过表达miR-221前列腺癌细胞与正常表达miR-221前列腺癌细胞基因表达的差异。利用在线分析工具GEO2R筛选出108个基因，其中18个基因上调，90个基因下调，如图2所示。

图1 所有样品前50个基因的表达情况

注：根据旁边色阶柱，越往下的颜色代表基因表达量下降。

图2 所有基因的火山图

注：红色：上调基因，绿色：下调基因，黑色：不受调控的基因。

2.2 基因功能富集分析 筛选出来的基因大多数位于细胞质、细胞核。这些基因通过双链RNA结合、螺旋酶活性、双链DNA结合、蛋白结合、单链RNA结合等发挥分子功能。此外，这些基因还通过参与调节Ⅰ型干扰素信号通路、对病毒的防御反应、病毒基因组复制的负调控、先天免疫反应等参与miR-221调控前列腺癌的发病过程。基因功能富集分析结果如图3所示。

2.3 KEGG信号通路分析 筛选出来的基因通过单纯疱疹感染信号通路、甲型H1N1流感信号通路、麻疹信号通路、RIG-I样受体信号通路、Toll样受体信号通路、乙型肝炎信号通路等途径参与了miR-221调控前列腺癌细胞的过程。KEGG分析结果如图4所示。

图3 差异基因功能富集分析

图4 差异基因KEGG信号通路分析

2.4 PPI网络和模块分析 基于PPI网络的分析之后，在Cytoscape中识别出75个节点和2 236个相互作用关系，如图5所示。其中相互作用关系较多的基因是中枢基因，因为相互作用关系多的基因与疾病的关系更加密切。其中信号转导和转录激活因子1-α/β(STAT1)、干扰素调节因子7(IRF7)、干扰素诱导的螺旋酶c结构域蛋白1(IFIH1)、干扰素诱导的GTP结合蛋白(MX1)、干扰素诱导的四肽重复序列3蛋白(IFIT3)、寡腺苷酸合酶2(OAS2)、泛素样蛋白15(ISG15)、依赖ATP的RNA解旋酶(DDX58)、鸟苷酸结合蛋白1(GBP1)、寡腺苷酸合酶1(OAS1)为前十位。 通过mcode分析，选择了1个模块，已经在图中圈出，这些基因具有一些共同的表达特征，值得我们进一步去研究，如图5所示。

图5 差异基因蛋白相互作用网络

3 讨论

前列腺癌是一种临床较为常见的疾病, 发病机制十分复杂, 当人体免疫力下降, 细胞内遗传物质DNA发生异常变化后, 细胞就会不受正常调节机制控制而出现异常生长, 产生癌变[8-9]。有研究表明[9-10]，前列腺癌的发生与结核杆菌和HPV病毒关系密切。本研究对miR-221过表达调控前列腺癌细胞差异表达的基因进行了筛选，共筛选出差异基因108个，其中18个上调基因，90个下调基因，对这些基因进行了基因功能和信号通路的富集分析结果表明，这些基因主要的功能有与双链RNA结合、双链DNA结合、蛋白结合、单链RNA结合，这些基因还通过参与调节Ⅰ型干扰素信号通路、对病毒的防御反应、病毒基因组复制的负调控、先天免疫反应，说明miR-221主要通过调控基因的这些功能，来参与前列腺癌的形成过程。这些基因主要富集在单纯疱疹感染信号通路、甲型H1N1流感信号通路、Toll样受体信号通路、乙型肝炎信号通路上，说明这些基因参与了病毒感染的调节过程。

构建了差异之间相互关系的PPI网络，其中STAT1、IRF7、IFIH1、MX1、IFIT3、OAS2、ISG15、DDX58、GBP1、OAS1为前10个枢纽基因。STAT1是信号转导和转录激活剂，介导细胞对干扰素(IFN)及其他生长因子的反应。随着Ⅰ型干扰素(IFN-α和IFN-β)与细胞表面受体的结合，通过蛋白激酶的信号传导导致JAK激酶的激活，磷酸化的细胞二聚体与ISGF3G/IRF-9结合形成一个复合物，称为ISGF3转录因子，进入细胞核。ISGF3与IFN刺激反应元件结合，激活IFN刺激基因的转录，使细胞处于抗病毒状态[11]。IRF7是Ⅰ型干扰素(IFN)依赖免疫应答的关键转录调控因子，在对DNA和RNA病毒的天然免疫应答中起着至关重要的作用。Ⅰ型干扰素基因(IFN-α和IFN-β)和IFN-刺激基因(ISG)的转录通过与其启动子中的干扰素刺激反应元件(ISRE)结合来调控。可以有效地激活IFN-β和IFN-α基因，并通过病毒激活的myd 88非依赖性途径和TLR激活的MYD88依赖途径介导它们的诱导[12]。IFIH1作为病毒核酸的细胞质传感器的天然免疫受体，在传感病毒感染和包括诱导第Ⅰ型干扰素和促炎细胞因子在内的一系列抗病毒反应的活化中起重要作用。MX1作为干扰素诱导的GTP酶结合蛋白，具有抗病毒活性，对RNA病毒和DNA病毒均有作用，它主要的作用目标病毒是负链RNA病毒和乙型肝炎病毒，作用方式通过核糖核衣壳结合和灭活[13-14]。IFIT3是干扰素诱导的抗病毒蛋白，可以抑制病毒复制。增强MAVS介导的宿主抗病毒反应，进入细胞核促进抗病毒基因转录[15]。OAS2和OASI是干扰素诱导的双链RNA激活的抗病毒酶，在细胞固有抗病毒反应中起着关键作用，它还可能在细胞凋亡、细胞生长、分化和基因调控等其他细胞过程中发挥作用[16]。ISG15作为泛素样蛋白，它在病毒感染的天然免疫反应中起着关键作用，DDX58作为天然免疫受体及病毒核酸的细胞质传感器，在检测病毒感染和激活一系列抗病毒反应中起着重要作用，包括诱导Ⅰ型干扰素和促炎细胞因子[17]。GBP1在两个连续的裂解反应中将GTP水解成GMP。具有抗流感病毒活性。促进氧化杀灭和提供抗菌肽自噬瘤小体，提供广泛的宿主保护对不同的病原体类别[18]。

差异基因的深入分析有助于确定miR-221调控前列腺癌发病机制中有用的靶点和途径。这些结果可为临床治疗靶点的研究提供理论依据。本研究筛选的中枢基因需要进一步验证，这可能成为未来研究的重点。