胡蜂蜂毒肽的固相合成

丁 靖, 赵 昱, 任 成, 张 炼, 胡婧雯, 方维臻, 陆 群*

(1. 西南交通大学，生命科学与工程学院，四川 成都 610031；2. 大理大学 云南省医学昆虫与蜘蛛资源开发利用重点实验室，云南 大理 671000)

胡蜂又称大黄蜂，其毒液含有大量的生物活性物质，经研究其具有潜在的生理学和药理学活性[1-4]。其中具有代表性的成分就是有亲脂亲水性的阳离子活性肽——胡蜂蜂毒肽(Mastoparan)，该多肽含有14个氨基酸残基，序列为COOH-Ile-Asn-Leu-Lys-Ala-Leu-Ala-Ala-Leu-Ala-Lys-Lys-Ile-Leu-NH2[5-7]。胡蜂蜂毒肽具有穿透细胞膜[6]，溶血[8-9]，抗菌[10-11]，抗病毒[12]，抗肿瘤[13-14]等广泛的生物活性。因此，高效、快速、大量合成胡蜂蜂毒肽对研究其生物活性具有重要意义。

VILA-FARRÉS X等采用固相合成法合成了胡蜂蜂毒肽[15-16]，但并未对其合成条件进行深入的研究。本文在此基础上，采用Fmoc固相合成法，以Wang树脂为载体，HBTU-HOBt为缩合剂，按照其氨基酸序列依次缩合，最终用切割试剂将其从树脂上切割下来，得到粗肽，经RP-HPLC纯化得到目标肽,纯度97.6%。经HR-MS(EI)分析，确定该肽为胡蜂蜂毒肽(Scheme 1)。

Scheme 1

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

UV-9100型紫外分光光度计；LC-6A型高效液相色谱仪；Agilent 6460型质谱仪。

Fmoc-Ile-Wang树脂，上海吉尔化学有限公司；1-羟基苯并三唑(HOBt)，上海思域化工科技有限公司；苯并三氮唑-N,N,N,N-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU),上海思域化工科技有限公司；其余试剂均为分析纯。

1.2 胡蜂蜂毒肽的合成

(1) 树脂的活化

称取2 g Fmoc-Ile-Wang树脂(取代度SD=0.7 mmol·g-1)置于50 mL的固相合成管中，加入20 mL DCM溶胀30 min。后用DMF(4×1 min)冲洗，抽干待用。

(2) 脱树脂保护

将20 mL 20%4-甲基哌啶/DMF加入固相合成管中，氮气吹拌反应，重复操作两次(1×5 min，1×30 min)。反应完毕分别以DCM(1×1 min)和DMF(1×1 min)交替冲洗4次。

(3) 脱保护效率的检测

取5 mg脱保护的肽树脂置于洁净的玻璃试管中，加入检测试剂A～C各2滴，于105 ℃加热3 min，树脂变为深蓝(阳性)，表明脱保护完全。

(4) 第二个氨基酸的缩合

称取2.51 g(4.2 mmol)Fmoc-Asn(Trt)-OH， 1.59 g(4.2 mmol)HBTU， 0.57 g(4.2 mmol)HOBt和1.46 mL(8.4 mmol)N,N-二异丙基乙胺(DIEA)于50 mL烧杯中，加入20 mL DMF溶解完全；加入脱保护的肽树脂，室温氮气氛围下反应2 h。缩合完毕，减压抽滤，肽树脂分别以DCM(1×1 min)和DMF(1×1 min)交替冲洗4次。

(5) 缩合效率的检测

取5 mg(3)(4)步骤的肽树脂置于玻璃试管中，加入检测试剂A～C各两滴，于105 ℃下加热3 min，树脂变为无色(阴性)，表明缩合完全。

表1 Fmoc-氨基酸投料比及用量

(6) 剩余氨基酸的缩合

重复(3)～(5)的步骤，按胡蜂蜂毒肽的序列，依次缩合剩余的氨基酸。若每次缩合完毕，树脂检测仍为阳性或弱阳性，需重复缩合，直至树脂检测为阴性。若重复缩合2～3次，树脂检测仍为弱阳性，无需重复缩合，加入封闭试剂乙酸酐/吡啶=1/1(V/V)以封闭未反应的氨基。胡蜂蜂毒肽的固相合成路线如Scheme 1，各氨基酸投料见表1。

(7) 树脂的切割

将合成的肽树脂抽干置于100 mL的圆底烧瓶中，加入40 mL切割试剂[三氟乙酸(TFA)/甲基苯基硫醚/H2O/苯酚/1,2-乙二硫醇=82.5/5/5/5/2.5,V/V/V/V/V]，室温搅拌2 h。抽滤，滤液加入200 mL冰甲基叔丁基醚，析出大量白色固体沉淀，离心沉淀，弃掉上清液。沉淀物再加入5 mL冰甲基叔丁基醚，离心，重复5次，得到粗肽。

1.3 纯化

将粗品肽用乙腈和水溶解，通过RP-HPLC纯化，采用Welch Ultimate AQ-C18柱(250 mm×50 mm，15 μm)，流动相A为乙腈，B为水，梯度洗脱，流速1.0 mL·min-1，检测波长为215 nm。

2 结果与讨论

2.1 表征

纯化后的胡蜂蜂毒肽经HPLC分析，保留时间为8.54 min，纯度为97.6%。经HR-MS(EI)分析发现740.70对应{[M+2H]2+}，1480.92对应{[M+H]+}。与该肽分子量1479.88相符，表明该肽为胡蜂蜂毒肽。

2.2 合成

(1) 树脂溶胀试剂

在本次实验中选择Wang树脂作为载体，在缩合之前，需要将树脂充分溶胀，使树脂上的活性基团充分暴露，提高缩合效率。本次实验采用DCM、 DMF和DCM/DMF=1/1(V/V)三种溶剂对树脂进行溶胀30 min(表2)。由实验结果可知，DCM对Wang树脂有更好的溶胀效果，因此本次采用DCM作为树脂溶胀溶剂。

(2) 缩合剂

在固相合成多肽中，缩合剂的选择也是影响缩合效率的关键因素，常见的主要有三种类型：碳二亚胺类，如N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)；磷正离子类，如PyBoP；脲正离子类，如HBTU[17]。而碳二亚胺类缩合剂在多肽合成中易发生副反应，使肽链片段消旋化。而本次合成中我们采用HBTU-HOBt作为复合缩合剂，此缩合剂不仅可以提高缩合效率，每步缩合率达99.9%以上，同时加入HOBt也可以抑制消旋化反应。

表2 不同溶剂对树脂的溶胀程度

(3) 反应溶剂

在合成过程中，反应溶剂对底物的溶解程度也会影响多肽的缩合效率。我们比较了DMF、 DCM和DCM/DMF=1/1(V/V)等3种溶剂对底物的溶解性，结果见表3。由表3可知，DMF和DCM/DMF=1/1(V/V)能够完全溶解底物，而DCM只能使底物部分溶解。由于DMF可以完全溶解底物，DCM可以使树脂溶胀，更好地暴露活性基团，从而可以更好地提高缩合效率。因此在此次合成中采用DCM/DMF=1/1(V/V)作为反应溶剂。

表3 不同溶剂对底物的溶解程度

(4) 氨基酸投料比

固相合成多肽时，每一步的缩合效率都会影响目标肽的纯度及产率，因此需选择适合的Fmoc-氨基酸投料比以提高缩合效率。在固相合成胡蜂蜂毒肽过程中，每一步缩合都以茚三酮显色剂做定性检测。结果显示在缩合前10个氨基酸，仅加入3倍量的Fmoc-氨基酸，茚三酮检测都为阴性，表明缩合率在99%以上。但发现随着肽链的延长，其缩合效率会有所下降，需要加入5倍量的Fmoc-氨基酸才能得到99%以上的缩合率。

(5) 脱保护试剂

Fmoc基团是否彻底脱除直接影响下一步的缩合，进而影响最终多肽的纯度，所以对脱保护试剂的研究非常重要。Fmoc基团在碱性条件下可有效脱除，通常采用20%哌啶/DMF作为脱保护试剂，但是哌啶为管制品试剂，难以购买。本次实验我们研究了50%乙醇胺/DCM， 20%4-甲基哌啶/DMF和5%哌嗪/DMF三种脱保护试剂的脱除效率。采用Fmoc定量检测方法测定脱保护效率[18]，该方法利用Fmoc基团在波长301 nm处具有很强的紫外吸收这一特点来计算脱保护的效率。结果如图1，20% 4-甲基哌啶/DMF对Fmoc基团有更好的脱除效果，反应3 min，脱除率可达到80%；反应5 min，即可达到99.9%以上。综上，本次实验采用20% 4-甲基哌啶/DMF作为脱保护试剂。

t/min

采用Wang树脂作为合成胡蜂蜂毒肽的载体，DCM作为树脂溶胀溶剂，HBTU-HOBt为缩合试剂，DMF为反应溶剂，20%4-甲基哌啶/DMF为脱保护试剂，TFA/甲基苯基硫醚/H2O/苯酚/1,2-乙二硫醇=82.5/5/5/5/2.5(V/V/V/V/V)为切割试剂，经RP-HPLC纯化，成功合成了胡蜂蜂毒肽。该方法具有操作简单、重复性好、成本低等优点。