干旱、盐胁迫及盐旱复合胁迫对青稞幼苗生理生化特性的影响

郑庆柱， 谭海运， 高 雪， 纪雪峰， 田 侠

(1.青岛农业大学资源与环境学院/青岛市农村环境工程研究中心，山东青岛 266109；2.西藏自治区农牧科学院农业资源与环境研究所，西藏拉萨 850000)

常见环境胁迫有干旱胁迫、盐胁迫、低温胁迫及重金属胁迫等[1]，以干旱与盐胁迫最为普遍。干旱是由气候异常所造成的自然灾害，发生频率高、影响范围广、危害性大[2]，严重危害农业生产，尤其西藏、新疆等干旱半干旱地区[3]，苗期干旱已威胁到藏区粮食安全和社会稳定。土壤盐渍化是我国农业生产面临的另一大难题，严重影响藏区青稞的幼苗生长。青稞(Hordeumvulgare)为禾本科大麦属作物，主要分布在我国西藏自治区、青海省、四川省及甘肃省等地，是青藏高原的重要农作物。由于青藏高原环境恶劣，青稞极易遭受干旱及盐分等环境胁迫，因此研究青稞特别是青稞幼苗期对干旱与盐胁迫的抗逆性对稳定和提高藏区青稞产量具有重要意义。

逆境胁迫可引起植物光合机构损伤及光合色素含量下降，降低其光合作用效率[4]。环境胁迫条件下植物体内活性氧产生与清除的动态平衡被打破[5]，从而使植物抗氧化酶的活性发生变化。目前，关于植物在逆境胁迫下的生理生化机制研究已有报道，井大炜等发现，水分胁迫下杨树幼苗光合作用减弱，超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)及过氧化氢酶(CAT)活性先升后降[6]；鞠乐等研究表明，水分胁迫下大麦SOD活性、丙二醛(MDA)含量、可溶性糖含量和蛋白含量显著上升，POD与CAT活性则先升后降[7]；韩浩章等报道，盐胁迫下香樟叶片光合速率下降，POD、POD活性先升后降[8]。尽管多种植物在环境胁迫下的光合特性与抗氧化酶活性的研究已有报道，但主要研究小麦、玉米幼苗、豌豆等适合丘陵与平原地带种植的作物，针对适合青藏高原种植的青稞的抗逆性研究报道较少。

采用水培法培养青稞幼苗，通过向营养液中添加聚乙二醇(PEG-6000)及NaCl模拟干旱胁迫、盐胁迫及盐旱复合胁迫环境，研究3种胁迫条件下青稞光合能力、渗透调节能力及抗氧化酶活性变化规律，以期为青稞抗逆性育种和栽培技术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试验设计

试验于2018年3—9月在青岛农业大学实验室进行，以藏青2000(西藏自治区农牧科学院提供)为研究对象，水培法培养青稞幼苗。种子先用纯水洗净，再用15% H2O2浸泡15 min，最后用纯水冲洗至无气泡。将种子移至铺有纱布和滤纸的托盘上，于20 ℃黑暗培养箱中催芽，种子露白后移植于石英砂中，每盆10株，置于培养箱培养。当幼苗长出2张真叶时用1/3 Hoagland营养液培养，9 d后换为 1/2 Hoagland 营养液再培养至3张叶时，将所有幼苗盆栽分7组。培养箱温度20 ℃/10 ℃(昼/夜)、光照度20 000 lx，光照周期14 h/10 h(昼/夜)，胁迫处理见表1。

表1 青稞3种胁迫处理方式

1.2 测定方法

1.2.1 叶绿素含量与相对水含量测定 叶绿素含量采用李合生的方法[9]测定。称0.2 g顶展叶，剪碎，加入50 mL提取液中(V乙醇∶V丙酮=1 ∶1)，在温度为25 ℃黑暗条件下提取 24 h，分别于440、645、663 nm处测吸光度，计算叶绿素含量。相对含水量根据Tambussi等的方法[10]测定。叶片测鲜质量后于蒸馏水中浸泡24 h，取出测饱和鲜质量，于温度为 80 ℃ 条件下烘24 h后测干质量，相对含水量=(鲜质量-干质量)/(饱和鲜质量-干质量)×100%。

1.2.2 气体交换参数与叶绿素荧光参数测定 气体交换参数采用Li-6400型便携式光合仪(美国 LI-COR 公司)测定，包括青稞叶片净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)和蒸腾速率(Tr)。温度和光照用便携式光合仪的温控系统和人工光源，CO2浓度为360 μmol/mol，光照度为700 μmol/(m2·s)，09：00—11：30测定。叶绿素荧光参数采用FMS-2型脉冲调制式荧光仪(Hansatech，英国)测定，将叶片暗适应20 min后测Fo和Fm。在3 000 μmol/(m2·s)强闪光下，测Fm′、Fs。PSⅡ最大光化学效率Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm、PSⅡ实际光化学效率ΦPSⅡ=(Fm′-Fs)/Fm′。

1.2.3 可溶性糖与可溶性蛋白含量测定 可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定。取干样粉0.1 g加入10 mL蒸馏水煮沸 30 min，冷却过滤，复提2次，滤液定容50 mL。取提取液加入蒽酮-硫酸溶液混匀，沸水浴10 min，冷却后在620 nm波长下测吸光度，计算可溶性糖含量。可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝法[11]测定。称鲜叶片0.5 g加蒸馏水研磨成匀浆，定容10 mL，室温放置1 h，离心，取上清液加入考马斯亮蓝G-250，混匀放置2 min后用分光光度计在595 nm下测D值，计算可溶性蛋白含量。

1.2.4 再二醛(MDA)含量及抗氧化酶活性测定 MDA含量采用硫代巴比妥酸法测定。取0.5 g叶片加入5 mL 10% TCA，研磨后的匀浆离心10 min，取上清液2 mL加0.6%硫代巴比妥酸(TBA) 2 mL混合，100 ℃水浴10 min后冷却离心取上清液在450、532、 600 nm 处测吸光度，根据公式C=6.45×(D532 nm-D600 nm)-0.56D450 nm计算MDA含量。

1.2.5 抗氧化酶活性测定 取叶片0.5 g于预冷研钵中，加1 mL磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液定容至5 mL，4 ℃ 离心10 min，上清液即为粗酶液。超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮蓝四唑(NBT)法，以抑制NBT光还原的50%为1个酶活性单位。过氧化物酶(POD)活性采用愈创木酚法，以1 min吸光度变化0.01/min为1个过氧化物酶活性单位。过氧化氢酶(CAT)活性采用紫外分光光度法，以吸光度变化0.01/min为1个酶活性单位。

1.3 数据处理

采用Origin 8.0处理数据，SPSS 19.0分析并用Duncan’s法进行显著性检验，显著性水平为α=0.05。

2 结果与分析

2.1 不同胁迫处理对相对含水量的影响

不同胁迫处理对青稞幼苗叶片相对含水量的影响见图1，不同胁迫均可导致相对含水量下降。DS3、SS3及CS3分别比CK降低3.1%、1.6%及9.4%，说明复合胁迫对植株影响最大，干旱胁迫次之，盐胁迫影响最小。DS5、SS5及CS5较DS3、SS3及CS3均有明显下降，分别降低14.0%、10.3%、13.8%，CS5最低，表明复合胁迫对青稞幼苗叶片相对含水量伤害最严重，胁迫时间越长影响越重。

2.2 不同胁迫处理对光合特性的影响

2.2.1 对叶绿素和类胡萝卜素含量的影响 从图2可以看出，3种胁迫条件下叶绿素与类胡萝卜素含量均呈增大趋势，随胁迫时间延长增大越显著。与CK相比，DS3、DS5、SS3、SS5、CS3及CS5叶绿素含量分别增加25.8%、35.5%、2.7%、5.9%、12.4%及20.4%(图2-A)，类胡萝卜素含量分别增加 17.1%、26.3%、1.3%、2.6%、5.3%及7.9%(图2-B)。表明干旱胁迫影响最大而盐胁迫影响较小，青稞在逆境中可通过增加叶绿素含量提高光合效率，缓解光合机构的伤害。

2.2.2 对气体交换参数的影响 从图3可以看出，3种胁迫均可使Pn、Gs、Ci与Tr显著下降，且随胁迫时间延长影响越显著。与CK相比，DS3、DS5、SS3、SS5、CS3及CS5中Pn分别降低19.6%、42.2%、8.2%、24.8%、27.7%及47.4%(图3-A)，Gs分别下降17.2%、42.2%、9.4%、20.3%、25.0%及57.8%(图3-B)，Ci分别降低29.4%、49.7%、5.1%、9.7%、8.8%及17.2%(图3-C)，Tr分别下降14.6%、31.0%、4.6%、18.0%、16.9%及36.7%(图3-D)。

2.2.3 对叶绿素荧光参数的影响 胁迫对叶绿素荧光参数的影响见图4，与CK相比，3种胁迫条件下Fv/Fm与ΦPSⅡ均显著下降且下降趋势相同，胁迫效应随胁迫时间延长而逐渐增强，其中DS5与CS5下降较明显，分别下降14.0%、22.1%。可见复合胁迫对叶绿素荧光参数影响最大，干旱胁迫次之，盐胁迫最小，表明复合胁迫对青稞叶片光合机构损伤最严重，盐胁迫最轻。

2.3 不同胁迫处理对可溶性糖与可溶性蛋白含量的影响

从图5可以看出，不同胁迫处理条件下可溶性糖和可溶性蛋白含量较CK总体上显著增加。DS3、DS5、SS3、SS5、CS3及CS5可溶性糖含量分别增加9.0%、45.1%、3.3%、24.3%、18.3%及74.4%(图5-A)；可溶性蛋白含量分别增加7.9%、23.0%、4.8%、20.2%、25.2%及44.2%(图5-B)，且随胁迫时间增加可溶性糖和可溶性蛋白含量的累积效应增强。可溶性糖与可溶性蛋白一起作为植物渗透调节物质调节细胞渗透压，以适应逆境胁迫。3种胁迫中复合胁迫影响最明显，干旱胁迫次之，盐胁迫最轻，表明在逆境中青稞叶片会进行糖和蛋白积累以调节细胞渗透压，且胁迫越严重，其累积量越多，CS5可溶性糖与可溶性蛋白含量分别达到6.96%及98.14 mg/g，表明复合胁迫下青稞体内渗透压最低，需要更多渗透调节物质调节渗透压，以减缓胁迫造成的伤害。

2.4 不同胁迫处理对青稞叶片MDA含量及抗氧化酶活性的影响

2.4.1 对MDA含量的影响 胁迫对青稞叶片MDA含量影响见图6，3种胁迫均可使MDA含量显著提高，其中复合胁迫提升幅度最大，盐胁迫最小。与CK相比，DS3、SS3及CS3分别增加28%、12.9%及37.6%，复合胁迫累积量最多。DS5、SS5及CS5比DS3、SS3及CS3分别增加12.6%、15.2%及16.4%，复合胁迫增加最明显。表明青稞受胁迫时体内自由基增多，细胞发生膜脂过氧化作用，造成MDA大量累积，且胁迫时间越长，MDA积累量越多，CS5 MDA含量最高，达到14.9 μmol/g，说明复合胁迫下青稞受到的伤害最大。

2.4.2 对抗氧化酶活性的影响 从图7可以看出，不同处理胁迫下SOD活性均显著增加，与CK相比，DS3、DS5、SS3、SS5、CS3及CS5分别增加85.3%、45.3%、72.9%、26.5%、110.1%及66.5%，复合胁迫最强；随胁迫时间延长，3种胁迫SOD活性均下降(图7-A)。当青稞受胁迫时，体内活性氧自由基增加，为了清除新增活性氧自由基，使活性氧的新增量与清除量维持动态平衡，故SOD活性增强；当伤害程度超过它自身所能承受的阈值时，则导致SOD活性减弱，不能有效缓解青稞受到的伤害。3种胁迫POD活性显著增强，与CK相比，DS3、SS3及CS3分别增加23.0%、11.9%及24.1%。DS5、SS5及CS5比DS3、SS3及CS3分别增加18.0%、17.0%及29.2%，CS5最高，为412.32 U/(g·min)，说明POD活性随胁迫时间延长而增强。复合胁迫影响最显著，POD活性最强，干旱胁迫次之，盐胁迫影响最小(图7-B)。3种胁迫CAT活性大幅增强，与CK相比，DS3、DS5、SS3、SS5、CS3及CS5分别增加28.6%、 60.0%、11.4%、40.0%、37.1%及94.3%，复合胁迫下CAT活性最强，干旱胁迫次之，盐胁迫最轻(图7-C)。总之3种胁迫下SOD活性随胁迫时间延长而减弱，POD、CAT活性随胁迫时间延长而增强，表明当青稞受胁迫时，POD与CAT活性变化趋势一致，协同增强植株抗氧化作用，以清除体内多余的活性氧自由基，减缓植株受到的损害。

3 讨论与结论

3.1 干旱和盐胁迫对相对含水量的影响

相对含水量是反映植物体内水分状态的重要指标，可指示其水分亏缺程度。研究表明，在逆境中植物叶片相对含水量降低，吴际友发现，干旱胁迫下红椿幼苗相对含水量降低[12]；杨国会发现，随NaCl浓度增加，甘草相对含水量持续下降[13]。本研究3种胁迫条件下青稞叶片相对含水量均下降，表明3种胁迫条件对青稞幼苗均有明显损伤，复合胁迫伤害最重。

3.2 干旱和盐胁迫对光合特性的影响

环境胁迫可影响植物叶绿素含量[14]，本研究发现，3种胁迫条件下青稞叶绿素含量均增加，与前人研究结果[15-16]一致，表明当胁迫浓度较低时，植物可加快叶绿素合成以增强光合作用，适应环境胁迫，此为植物积极应对逆境的生理响应。逆境胁迫下植物叶片相对含水量降低，水是光合作用的原料，缺水可直接影响光合作用，也可导致叶片气孔关闭，限制CO2进入，从而间接降低光合作用效率，故3种胁迫对光合参数影响显著。本研究发现，3种胁迫下青稞幼苗Pn、Gs、Ci与Tr均显著下降，与前人研究结果[17]一致。水分胁迫可降低植物净光合速率，主要由于气孔限制[18]，也有报道水分胁迫时植物净光合速率降低的原因是非气孔限制[19]。Ci是分析净光合速率降低原因的重要指标，本研究3种胁迫下Ci与Pn均明显下降，表明逆境胁迫下青稞光合能力下降是由气孔因素引起的，属于气孔限制。叶绿素荧光参数也能较好地反映植物生理状况，本研究发现3种胁迫下青稞叶片Fv/Fm与ΦPSⅡ均下降，该结果与前人研究结论[19-20]一致，表明光合效率与伤害程度呈负相关。

3.3 干旱和盐胁迫对可溶性糖与蛋白含量的影响

可溶性蛋白易溶于水且亲水性较强，可提高植物吸水动力，可溶性糖对植物细胞膜和原生质体具有一定的保护作用，二者均为植物渗透调节物质。当植物处于干旱或盐等渗透胁迫时，组织细胞内渗透调节物质可不断累积以增加细胞渗透压，提高自身保水能力适应逆境条件。逆境胁迫下植物体内积累的可溶性糖与可溶性蛋白越多，其抗逆性就越强[21-22]。本研究3种胁迫下青稞幼苗体内可溶性糖与可溶性蛋白含量均明显积累，与前人研究结果[23-24]一致。表明青稞幼苗在受到渗透胁迫时，其体内渗透调节物质会迅速累积，以抵御外界环境胁迫，缓解所受伤害。

3.4 干旱和盐胁迫对MDA含量及抗氧化酶活性的影响

干旱条件下马铃薯叶片MDA含量升高[25]，盐胁迫下胡卢巴幼苗MDA含量上升[26]。本研究3种胁迫条件下青稞幼苗叶片MDA含量均显著增加，复合胁迫MDA含量最高，表明复合胁迫对青稞幼苗的伤害最大，膜脂受损程度最严重。植物生长过程中可产生活性氧自由基，正常条件下活性氧的产生与清除维持动态平衡，SOD、POD及CAT等抗氧化物酶相互协调，确保植物体内活性氧自由基维持在较低水平，防止细胞受损。当遭受环境胁迫时，活性氧产生与清除的平衡状态被破坏，活性氧自由基在植物体内加速累积。SOD是植物体清除活性氧的第1道防线，它可将活性氧自由基转化为H2O2与O2，CAT与POD负责清除H2O2，减缓胁迫条件下活性氧对植物体的伤害。干旱与盐胁迫下，植物利用酶促反应可将其体内过多的活性氧清除，以增强抵抗能力，SOD、POD及CAT活性也显著提高，以增强活性氧清除能力[27-28]。本研究干旱胁迫和盐胁迫条件下SOD、POD及CAT活性均显著提高，其中复合胁迫活性最高，表明复合胁迫下活性氧自由基最多，受伤害最严重。随胁迫时间延长，SOD活性均先升后降，POD及CAT活性均上升，酶活性在3种胁迫条件下变化趋势相同，表明青稞幼苗体内SOD、POD及CAT对干旱胁迫和盐胁迫的应答方式基本一致。

干旱胁迫、盐胁迫及盐旱复合胁迫对青稞幼苗叶片相对含水量、光合特性、可溶性糖与可溶性蛋白含量、MDA含量及抗氧化酶活性均有显著影响，且盐旱复合胁迫最显著，随胁迫时间延长，胁迫效应越显著。3种胁迫下，青稞幼苗叶片相对含水量降低；叶绿素含量升高，但由气孔限制造成青稞幼苗光合能力下降，光合效率降低；体内可溶性糖与可溶性蛋白等渗透调节物质迅速累积，以抵御外界环境胁迫，缓解自身所受到的伤害；MDA含量显著增加，SOD、POD及CAT活性显著提高。青稞幼苗叶片中抗氧化酶系统在3种胁迫下应答方式基本一致，随胁迫时间延长，青稞幼苗SOD活性先增强后减弱，POD与CAT活性逐渐增强。