植物抗白粉病MLO基因研究进展

田永贤， 陈 敏， 王其刚， 张 颢， 邱显钦

(1.云南大学生命科学学院，云南昆明 650091； 2.云南省农业科学院花卉研究所/国家观赏园艺工程技术研究中心，云南昆明 650205)

自然界中的植物与病原菌在长期的协同进化过程中形成了一种动态平衡关系，植物产生了一套保护自身的防御体系[1]。目前，国内外大量实验室专注于研究植物的抗病机制，筛选出抗病的突变体植株，分离并克隆相关的抗性基因[2]，以培育生产所需的抗病植株。植物存在2类基本抗性基因，一类是抗病基因(resistace gene，简称R)，R基因是植物体中能特异性识别病原并能激发抗病反应的一类半显性和显性抗性基因，其特点是“基因对基因”式、专一和高效，因其种族特异性强，几年内，病原菌便可克服R基因赋予植物的抵抗力而引起流行病大暴发[3-4]，原来的抗病品种因产生新的病原菌生理小种而丧失抗性。综合评价其利用价值，用该基因培育抗病品种操作较容易且抗病性高，但其抗病性不能稳定和持久。另外一类是感病基因(susceptibility gene，简称S)，其为植物易感性所需，与植物的感病性有关，负调控植物的抗病过程。S基因功能的丧失会使植物获得隐性遗传的抗性，其等位基因正好弥补了R抗性上的缺点[4-5]，因此S基因的抗病模式是不同于R抗病植株的，而本文所分析的MLO家族基因就是S基因的一种。

1942年，Freisleben等使用X-rays(X射线)诱变了德国大麦(Hordeumvulgare)品种Haisa，获得的突变体产生了对大麦白粉菌(Blumeriagraminisf.sp.hordei，简称Bgh)的广谱抗性，mlo抗性从此为人们所了解[6]。1992年Jørgensen获得了目前被普遍利用的mlo基因突变体中仅有的自发突变植株mlo-11[7]。随后人们又从谷子(Setariaitalica)[8]、拟南芥(Arabidopsisthaliana)[3]、野蔷薇(Rosamultiflora)[9]、豌豆(Pisumsativum)[10]和苹果(Malusdomestica)[5]等植物中分离克隆了MLO同源基因，形成了MLO基因家族。目前仅发现其存在于植物和苔藓类中，表明该家族基因是植物所特有的抗病基因[11-12]，MLO基因是一类单基因控制的隐性抗病基因，mlo突变体具有对白粉菌广谱、高效且持久的抗性[7，11，13]。

传统育种利用R基因来培育抗病品种，由于R基因高度的专化性，短短几年，白粉菌便可克服这种抗性而产生新的生理小种，导致原来培育的品种失去对新小种的抗病能力，甚至可能引起新生理小种大暴发，极大影响作物的生产，因此R基因的利用不是一个长久之计。MLO基因是一种S感病基因，MLO基因对植物的抗病过程起负调控作用，野生型植株均能通过引起MLO基因功能丧失的突变获得mlo基因抗性，由于mlo基因具有白粉菌持久而广谱的抗性，因此这类基因在改善植物抗性方面具有广泛的应用前景和开发潜力，MLO家族基因的研究对植物抗病育种具有十分重要的意义。

1 MLO基因的生物信息学研究

1.1 亚细胞定位

1999年Devoto等推测大麦MLO蛋白定位于细胞质膜上，现在已有大量研究进行了MLO蛋白的亚细胞定位，例如蔷薇科(Rosaceae)植物的82个MLO蛋白中，大多数分布于质膜中，其次分布于内质网和液泡中，还有少量分布于细胞核、线粒体和高尔基体中[9]；激光共聚焦显微镜观察发现，葡萄(Vitispseudoreticulata)的5个MLO蛋白均定位在细胞膜上，在细胞质内有少许的MLO蛋白[14]；谷子的12个MLO蛋白亚细胞定位分析表明，大部分MLO蛋白定位于细胞膜上，少数位于细胞核和细胞质中[8]；石甜甜等研究证明，糜子(PanicummiliaceumL.)MLO蛋白定位于细胞质膜上[15]。Bhat等发现无白粉菌感染的mlo突变体中大多数MLO蛋白聚集在表皮细胞周围，在内膜及核膜上也检测到了一些MLO蛋白，而在已接种白粉菌孢子的叶片上，真菌附着胞下呈现明显的MLO蛋白聚集，这表明MLO蛋白在质膜中重新分布，且这种聚集受脂筏的驱动而不受肌动蛋白的影响[16]。李凡在无白粉菌感染的野生型和突变体的表皮细胞中均没有发现MLO蛋白的特异性标记位点[17]，表明该蛋白在无白粉菌条件下的表达丰度较低，而在侵染后的表皮细胞内的吸器外基质中发现特异性的蛋白标记位点，说明MLO蛋白特异性地定位在吸器外基质中，侵染后的现象与Bhat等的研究结果[16]相同，即在病原菌侵染后，MLO蛋白会重新分布并且聚集在附着胞下方的基质中。另外在白粉病菌的吸器和菌丝等部位中均有胶体金的特异性标记位点，推测MLO蛋白可能是病原菌成功侵染所必需的1种寄主因子或者是病原菌发育的1种必要组分[17-18]。

Devoto等对MLO蛋白的亚细胞定位研究表明，MLO蛋白中心疏水区域具有7个跨膜结构域(seven-transmembrane domain，简称7TM)，其N端在细胞外，通常是与配体结合的结构域，C端在细胞内，存在与G蛋白结合的结构域[19]。MLO蛋白的拓扑结构、亚细胞定位及序列多样性类似于动物和真菌7TM的G蛋白偶联受体(G-protein coupied receptors，简称GPCRs)[20-21]。在动物中G蛋白偶联受体GPCRs可以结合并激活异源三聚体G蛋白的活性，目前有研究从异源三聚体G蛋白是否参与MLO蛋白与白粉菌的互作过程来证明植物MLO蛋白是否具有G蛋白偶联受体的功能，G蛋白由3个不同亚基(Gα、Gβ、Gγ)组成，调节植物许多基本过程，在植物中G蛋白复合物具有组成型活性，但其在该过程中的确切作用尚不清楚[22]。Kim等发现异源三聚体G蛋白不涉及MLO感病性或者突变型mlo介导的抗性活动，指出MLO蛋白似乎独立于异源三聚体G蛋白起作用[23]；研究发现Gβ和Gγ亚基在拟南芥mlo-2突变体中参与调节抗真菌的防御反应，Gγ1亚基在该突变体中影响胼胝质的积累，但总体上与MLO蛋白作为典型GPCRs的作用不一致[22]。

1.2 跨膜结构域

过去一直认为MLO蛋白具有7个跨膜结构域[11，24-25]，如今研究发现MLO蛋白的跨膜结构域数量存在差异，例如，已公布蔷薇科植物的81个MLO蛋白中，仅有1个MLO蛋白为4个跨膜结构域，其他的为5～8个跨膜结构域；闫沛喆等发现，芸薹属(Brassica)的123个MLO蛋白中有71个拥有超过7个跨膜结构域[26]；原子吸收光谱结果表明，糜子MLO蛋白没有跨膜结构域[15]；陈玲等研究的85条MLO蛋白中，低等植物的跨膜结构域最多，为5个，高等植物有6～8个跨膜结构域[27]；Chen等研究认为，MLO蛋白数量在低等植物与高等植物间有所变化，不足5个跨膜结构域的MLO蛋白通常存在于低等植物中，跨膜结构域为4～8个的MLO蛋白通常存在于高等植物中[28-29]。陈玲等推测这种差异可能是由种间进化或不同物种自身特性促成的[27]，由此看出MLO蛋白跨膜结构域数量不是一定的，且仅部分MLO蛋白保持了该结构域数量上的保守性[29]。

1.3 钙调素结合区

钙调素(calmdouiln，简称CaM)是一类多功能的钙受体蛋白，广泛存在于真核细胞中，以受体的形式参与动植物细胞中多种酶和生理过程的调节。钙调素特定结合区域(CaM binding domain，简称CaMBD)位于第7个跨膜结构域后10～15个氨基酸的位置[14，24，30]，该结构在已鉴定的MLO蛋白家族中非常保守[23，31]。向贵生等对HvMLO、TaMLO1、TaMLO2和TaMLO3的CaMBD结构域位置进行预测，结果与上述位置一致，但对蔷薇科植物MLO蛋白该结构域进行预测时，发现CaMBD位于TM3与TM4之间，更接近TM4，与之前的结论是不相符的，由此推测CaMBD在物种的进化过程中可能出现了某些变化导致其位置发生了改变[9]。目前，大量研究支持MLO蛋白与钙调素之间存在相互作用，并且MLO蛋白的活性受钙调素调节，例如，Bhat等发现在入侵位点MLO蛋白与钙调素的增加与病原菌成功入侵宿主细胞发生的时间一致，证明钙调素参与了MLO与病原菌的互作[16]；王晏青通过酵母双杂交方法验证了VpMLO7蛋白与钙调素互作[14]；有证据表明，钙调素直接与受体结合，参与GPCRs介导的信号传导过程，Kim等认为，MLO蛋白是一类新型钙调素结合蛋白，调节植物的防御反应和细胞死亡，其活性受钙调素的调节[23，32-33]。另外CaMBD结构域并不是存在于所有的MLO蛋白中，也不是具有抗病功能的MLO蛋白所特有的[34]。

1.4 信号肽的分析

信号肽是引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短肽链，长度为5～30个氨基酸，位于分泌蛋白的N端，其可将进行翻译的核糖体附着于粗面内质网上，并引导蛋白质输送到细胞内不同膜结构的亚细胞内[35-36]。至今关于MLO蛋白中信号肽的研究相对较少，且只有少部分MLO蛋白具有信号肽，目前对信号肽的报道有：覃碧等对木薯(ManihotesculentaCrantz)MLO蛋白的研究发现，MeMLO8、MeMLO10和MeMLO18蛋白各有1个N端信号肽，拟南芥的3个蛋白AtMLO7、AtMLO8和AtMLO10也各有1个N端信号肽，这些信号肽均与第1次跨膜结构存在重叠区[34，37]，巴西橡胶树HbMLO9含有1个N端信号肽[38]，感病小麦(TriticumaestivumL.)品种豫麦13和抗病品种红蚰麦的MLO蛋白中均有1个信号肽[39]，小麦TaMLO8蛋白具有1个信号肽[40]，糜子PmMLO蛋白也具有信号肽[15]等。不是所有的MLO蛋白都含有信号肽，大部分MLO蛋白不具有信号肽，例如谷子的12个SiMLO蛋白[8]，巴西橡胶树(Heveabrasiliensis)HbMLO7[41]、HbMLO1-1[42]、HbMLO8[43]、HbMLO12蛋白[44]，蓖麻(RiciunscommunisL.)15个RcMLO蛋白[37]，小扁豆(LensculinarisMedik.)13个LcMLO蛋白[45]，玉米(ZeamaysL.)ZmMLO蛋白[21]，木薯19个MeMLO蛋白，拟南芥12个AtMLO蛋白及小麦3个TaMLO蛋白[34]等均没有N端信号肽结构。

1.5 C末端的保守结构域分析

双子叶植物和单子叶植物的多重序列比对揭示出2个保守的肽结构域(Ⅰ和Ⅱ)，第1个位于钙调素结合结构域下游15～20个残基处，该保守结构域的特点是存在保守的丝氨酸和苏氨酸残基，第2区域位于C末端的远端，是带有共有序列D/E-F-S/T-F的肽结构域，值得注意的是，该模式在C-末端的一级氨基酸序列内的相对位置并未严格固定，该基序与上游(CaMBD和第一保守基序)和下游锚点(C-末端)的距离似乎是可变的[46]。目前，已从番茄(LycopersiconesculentumMill.)、拟南芥、大麦、水稻(Oryzasativa)、玉米、小麦、甘蓝型油菜(BrassicanapusL.)、辣椒(CapsicumannuumL.)[28，46-48]及月季(RosachinensisJacq.)[49]等植物中克隆出MLO蛋白的2个保守基序。Feechan等提出MLO蛋白C端的这2个保守性结构域可能与植株对白粉病的敏感性相关[30，46]，并提出第Ⅳ和第Ⅴ分支中的MLO蛋白C末端均存在这2个保守结构域，其他分支也可能存在这2个结构域[46-47，49]，已公布的与白粉病互作的MLO基因均位于这2个分支中，但这2个分支上的MLO基因并不都是抗病基因[50]。向贵生等研究发现，这2个分支上的基因并不都具有这2个保守结构域，似乎这2个保守结构域只存在于这2个分支中具有抗病能力的基因中[9]。虽然大量研究发现，这2个保守结构域主要存在于有抗病能力的MLO基因中，但是这2个结构域并不是抗病基因所特有的，其他分支也存在这2个结构域，因此这2个结构域在MLO基因与病原菌互作中的作用需要进一步确定[47-48，51]。

1.6 MLO蛋白的保守性分析

Winterhagen等分析了17个葡萄和大麦MLO蛋白的氨基酸序列保守性，得出MLO蛋白中有30个保守的氨基酸残基[52]。Elliott等分析了来自不同物种的38个MLO蛋白的氨基酸序列，指出MLO蛋白中同样具有30个保守的氨基酸残基[53]。刘宝玲等对谷子的12个MLO蛋白氨基酸保守位点预测发现，有1/2具有相同的30个氨基酸残基，其余蛋白则突变或丢失了保守基序[8]。Zhou等对黄瓜14个MLO蛋白研究发现，只有6个保留了30个氨基酸，其他则为丢失和突变的氨基酸残基[54]。Win等分析了南瓜的20个MLO蛋白，发现只有少部分保持了这30个氨基酸的完整性，其余都发生或多或少的氨基酸残基的缺失或突变[55]。蔷薇科的82条MLO蛋白中有15个保守基序，长度在15～50个氨基酸之间[9]；对黄瓜(CucumissativusL.)、甜瓜(CucumismeloL.)和西瓜(Citrulluslanatus)42个MLO蛋白的保守基序进行分析，结果发现42个MLO蛋白具有20个保守基序，长度在11～40个氨基酸之间[56]，这些保守基序可能与MLO蛋白的功能相关[57]。陈玲等在截选的MLO蛋白中发现，氨基酸变异位点占总氨基酸位点的84.14%，其中保守位点数仅占0.58%，体现出氨基酸序列具有较大的变异和较低的保守性[27]。变异区主要存在于N端、C端和胞外第1个环区域的序列[20，46]。

2 MLO基因功能分析

2.1 MLO家族基因的分类及其相关的功能

为了分析MLO蛋白成员间与其他物种MLO蛋白间的进化关系，常常构建系统进化树，覃碧等构建了木薯和其他物种MLO蛋白间的系统进化树，将MLO蛋白家族成员分为6类(Ⅰ～Ⅵ)，并推测感病MLO基因似乎仅限于第Ⅳ和第Ⅴ类[34]；李明想构建的系统进化树将单子叶和双子叶植物MLO蛋白分为6个亚家族，发现第Ⅳ和第Ⅴ亚家族的成员参与白粉菌的感病过程[5]；大多数研究把MLO基因分为7个亚家族，发现能与白粉菌互作的MLO基因可能只存在于第Ⅴ和第Ⅳ分支上[58-59]，且双子叶植物中抗白粉病基因位于第Ⅴ分支，单子叶植物的该类基因都位于第Ⅳ分支上[55，60]。值得注意的是这2个分支上的基因并不都是与抗性相关的基因[50]。

研究发现，第Ⅲ分支上的MLO蛋白可能是被子植物受精过程中配子体功能的1个关键调节因子，可调控花粉管的发育，影响植物的育性[61-62]，Davis等认为，其他分支的MLO蛋白可能参与拟南芥的生殖生长[63]，EST(表达序列标签)表达分析表明，MLO蛋白广泛地参与到黄瓜、甜瓜和西瓜器官的营养生长和生殖生长中[56]。研究发现，HbMLO9和HbMLO1-1蛋白参与橡胶树的激素信号传导以及逆境响应过程[42，64]，苹果MdMLO蛋白参与了机械损伤胁迫和外源水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)及1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)诱导胁迫过程[5]，水稻中4个和5个MLO蛋白分别与热和冷胁迫的反应相关[65]，TaMLO8蛋白参与了条锈菌和白粉菌的抗病反应过程[40]，大麦MLO基因转录丰度随着Bgh、稻瘟病菌、创伤、百草枯处理以及小麦白粉病产生的碳水化合物诱导物而增加。以上研究结果表明，MLO蛋白广泛参与生物和非生物的胁迫反应[66]，MLO家族成员之间存在功能互作的现象，导致不同的MLO蛋白共同响应某种胁迫反应[5]。目前，许多研究表明，MLO基因的表达模式在不同的组织中存在着差异，在不同的组织中表达量不同，由这些差异推测MLO基因还存在其他的功能[13，64]。至今，已经发现了大量的MLO家族基因，但是对其功能的研究尚且不足，研究得最多的是MLO家族成员使植物易感染白粉病，第Ⅳ和第Ⅴ分支的成员类群主要功能与白粉菌的防御有关，但对其他分支的成员主要功能尚且分析不足。

2.2 与白粉病相关的MLO基因

王晏青研究发现，MLO基因在白粉菌诱导的早期表达量急剧上升，证明了MLO基因是在侵染的早期协助病原菌入侵寄主植株的[14]。野生型MLO基因能调控表皮细胞内乳突的形成，在表皮细胞壁真菌侵染位点抑制细胞壁过氧化氢暴发，并且抑制叶肉细胞次级氧化暴发和叶肉细胞死亡，利于病原菌的侵入，削弱了植物的防御能力，这类基因负调控植物防御能力以及细胞死亡[66-67]。MLO基因的缺失或移码突变获得等位基因mlo，导致MLO蛋白功能的丧失，解除了对白粉菌抗性和细胞死亡的负调控，因此植物产生了对白粉病的持久、高效和广谱抗性。有研究证明，MLO基因并不是完全抑制抗性，Peterhänsel等发现野生型MLO植物可以阻止30%左右的真菌孢子穿透宿主表皮细胞壁，并能观察到mlo抗性产生的系列防御反应[68]；将额外的MLO基因导入野生型MLO细胞后敏感性的增加表明，内源纯合野生型MLO基因抑制对白粉病的抗性反应是不完整的[23]；Piffanelli等认为，病原菌诱导MLO基因的组成型过表达与诱导之前的低表达相比可以解释为野生型MLO对mlo抗性的不完全抑制[66]。

同一个基因也可具有多种功能，即基因功能具有多效性，例如抗病功能的基因可以同时响应伤处理[5]，在某些物种中，MLO基因的敲除会导致多种表型，例如，大麦叶片自发的细胞死亡形成的坏死斑点和大麦谷粒产量的降低[7，16，68]；拟南芥生长缓慢、早衰并且无感染的叶片出现自发的胼胝质沉积[3]；辣椒植株大小减少[48]。侵染白粉菌的转基因pFGC1008-CmMLO甜瓜，具有白粉病抗性，同时植株出现卷须早，长势较对照野生型植株弱，叶片大小、色泽没有明显区别[69]。但家养苹果的MLO基因敲除并未观察到这种或其他意外的多效表型[70]。小麦mlo突变体植株的高度、穗数及种子数较野生型没有明显的差异，也未出现较早叶片黄化的现象[71]。Ge等突变了埃塞俄比亚的1个大麦地方品种Eth295，发现其MLO突变不表现出自发坏死和光合组织丢失的多效性[72]。有研究者分析了影响这些多效表型形成的因素，Peterhänsel等认为，自发的细胞死亡由MLO和ROR调控[68]，可能与突变体叶片的加速衰老有关[66]。Consonni等研究发现，胼胝质的自发沉积和衰老样表型仅在Atmlo2pen2中被抑制，而不是在Atmlo2pen1或Atmlo2pen3中被抑制，这说明PEN2的突变补偿了突变体中失去的表型[3]，而在大麦中mloror2突变体植株限制了这种多效性[68]。因此mlo突变体是否引起多效表型需要进一步的研究，如果能够产生这种多效表型，那么之前研究发现的PEN2或ROR2是否影响这种多效表型以及是否其他因素影响这种多效表型都需要进一步的研究。

研究证明MLO基因存在功能冗余现象，导致突变的mlo基因对白粉病的抗性不同，因此在培育抗病品种时，当存在多个MLO基因拷贝同时调控白粉病时，植物要获得高抗或者完全免疫白粉菌，需突变植株中起主要作用的MLO基因或者突变全部调控白粉病的MLO基因。Consonni等突变拟南芥的3个同源基因(AtMLO2、AtMLO6和AtMLO12)，通过形成单突变体、双突变体和三突变体，证明了3个同源基因存在功能冗余，而AtMLO2在对白粉菌的防御过程中起主导作用[3，47]。Pessina等研究苹果的MdMLO基因，敲除MdMLO19基因使白粉病严重程度降低75%，MdMLO11基因或MdMLO19基因与MdMLO11基因组合的敲除与单独敲除MdMLO19基因相比不会导致任何减少或额外的易感性降低，证实了MdMLO19在植株中起主要的抗病作用[70]。Piffanelli等发现，大麦17个mlo的等位基因中，mlo-12和mlo-28基因仅有部分抗性，其余具有完全抗性[66]；Zheng等发现，同时沉默番茄SlMLO1及其同源物SlMLO5和S1MLO8赋予比与SlMLO1突变相关的更高水平的白粉病抗性，这证明与白粉菌互作的番茄MLO同源基因存在功能冗余[73]。这些研究结果均说明MLO基因存在功能冗余的现象。

3 MLO基因的抗病机制

3.1 表皮细胞中MLO基因的抗病调控

Blume等认为，细胞质中Ca2+的持续增加是激活细胞防御所必需的[74]。韩德俊等指出，表皮细胞外Ca2+的流入不仅是MLO基因表达所必需的，并且促进了胼胝合成酶(1，3-β-glucan synthase)活性提高从而有助于乳突的形成[33]。研究发现，表皮细胞中Ca2+的增加也能促成抗性的抑制，前期病原菌激发抗病反应，并引起Ca2+内流，但MLO的表达受到抑制；抗性抑制发生在后期MLO蛋白量的恢复时期，当胞质内的Ca2+迅速增加时，CaM的含量也显著增加，而MLO蛋白的活性在CaM的调节下升高，抗性显著被抑制，植物表现为感病性[23，75]。邵伯飞发现，钙调素能够使细胞维持一个低浓度的Ca2+水平，并且抗病或感病品种的表皮细胞是否成功被病原菌侵染依赖于胞质内的Ca2+是否保持较低的浓度。总的来说，Ca2+的增加既可引发抗性，同时也可以抑制抗性。在侵染后期，吸器外膜结构发生变化，钙调素大量流入吸器外基质中[75]。野生型MLO植株接种白粉菌后，其表皮细胞的CaM蛋白主要积累于对着吸器部位的细胞壁内层，并认为CaM蛋白与代谢水平有关，因此推测这个部位的代谢更为活跃，可能有助于吸器的发育[18，76]。另外对MLO蛋白的亚细胞定位后发现，在病原菌的不同器官中以及吸器外基质中都有密集的特异性标记位点，推测MLO蛋白及其衍生物是病原菌成功入侵和发育所必需的植物因子和寄主因子[17-18]。基于这2种物质都主要定位于吸器外基质中，推测也可能在这个位置2种物质间互作调控了植株的抗病性。在表皮细胞中重要的一个防御方式是乳突反应(papilla response)，这是寄主抵抗白粉菌入侵时形成的一种典型的非专化型防御反应。乳突抗性体现为抗初侵染，而抗初浸染的关键在于高频率快速产生乳突[77]。

3.1.1MLO基因调控乳突反应所需的渗透抗性通路MLO基因负调控植物的抗病反应，这种负调控与2个独立渗透抗性通路相关，第1个通路由突触融合蛋白PEN1/ROR2介导，该蛋白在调控囊泡运输过程中发挥作用，并且MLO和ROR2蛋白之间存在直接的互作关系。糖基水解酶PEN2和ABC转运体PEN3参与了第2个通路[78]。研究发现，大麦ROR(ROR1和ROR2)基因是mlo基因产生对白粉菌的完全抗性所必需的[79-80]，Collins等在拟南芥的突变体中分离出3个基因，分别是PEN1、PEN2和PEN3，这3种基因影响非宿主抗性，有趣的是，这3种基因也被发现是基于Atmlo2的白粉病抗性所必需的[80]。

第1个通路由突触融合蛋白PEN1/ROR2介导，大麦ROR2和拟南芥PEN1互为直系同源基因，具有分泌的基础功能和专门的防御相关功能，为乳突形成过程中的极化分泌事件所必需。PEN1/ROR2基因能够编码含有SNARE结构域的质膜驻留的突触融合蛋白[78]。靶膜蛋白HvSNAP34(syntaxin-interacting N-ethylmaleimide sensitive factor adaptor protein receptor proteins)是SNAP-25(synaptosome-associated protein，molecular mass 25 ku)的一种同源物，是mlo基因完全抗性所必需的[80]，当其与突触融合蛋白ROR2结合成二元SNARE(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)复合物后，参与mlo抗性完全表达所需的生物囊泡运输，因为SNARE蛋白具有介导胞外防御中的胞吐和/或囊泡融合事件，而MLO蛋白可调控细胞外周的SNARE蛋白介导的囊泡过程从而影响mlo抗性[16]。在mlo突变型的拟南芥中，生化研究表明PEN1在植物体内能与囊泡相关膜蛋白(VAMP)72亚家族成员相互作用，PEN1依赖性抵抗主要通过2个功能冗余VAMP721和VAMP722在体内起作用，遗传分析表明，VAMP722优先与PEN1和SNAP33蛋白形成三元SNARE复合物，从而调控囊泡运输[81]，依赖PEN1的抗病机制可能是限制入侵后病原菌的生长[3]。PEN1可直接调控mlo突变体的抗性，其突变直接抑制mlo的抗性[82]。

第2个通路由糖基水解酶PEN2和ABC转运体PEN3所介导。mlo抗性依赖于PEN2和PEN3，据推测，PEN2(atypical myrosinase)和PEN3[ATP Binding Cassette(ABC) transporter]分别参与从硫代吲哚葡萄糖酸盐衍生的有毒次生代谢物的合成和跨膜外流，以限制病原体的侵袭[83-84]，PEN2和PEN3不同于PEN1直接影响mlo基因的抗性发挥作用，而是这2个基因可能调控白粉菌进入宿主细胞的途径间接调控mlo抗性[3]。PEN2和PEN3参与限制更广泛的病原体的生长，包括适应性生物营养性白粉病、死体营养真菌和半营养卵菌[78]。

3.1.2 乳突的形成 Bushnell等认为，植物侵染白粉菌后的第一可见反应是宿主细胞质聚集在病原菌附着胞的下方，并把这种细胞质聚集形成的凝块称为细胞聚集体，该聚集体包括快速移动的细胞质、细胞器，具有与高代谢和合成活性区域相关的特征：丰富的线粒体、粗面内质网、高尔基体和多核糖体[85-86]。经生化分析和组织化学的研究表明，细胞聚集体内含有蛋白质、脂质和多酚类物质，木质素和纤维素表现为负染色，认为这2种物质不存在于该聚集体中[87]，Russo等证明有胼胝质的存在[88]。

大量研究表明，真菌释放的化学诱导剂参与了细胞质聚集体的启动[89-90]，而乳突的形成依赖细胞质聚集体的存在，在细胞聚集体形成不久便开始了乳突反应，并且主要产生在细胞质聚集的中心[86，91-92]。Zeyen等认为经过细胞质聚集体作用的乳突的沉积过程分为4个步骤[91]。在细胞聚集体中检测到类似乳突成分的囊泡物质和水解酶类物质，在乳突及其周围事物宿主细胞质的定位表明，乳突的形成是通过原生质体中分泌的囊泡内含物的积累，这部分内含物至少有一部分来自溶酶体系统[93]。在乳突的形成过程中，由于在细胞质聚集体中的与质膜结合的膜囊泡中发现具有类似的电子不透明性的无定形材料，甚至可以看到囊泡中存在胼胝质，在质膜附近经常观察到与膜结合的囊泡，注意到囊泡膜-质膜连续性，能够看到囊泡膜与质膜融合，推测这一过程使得囊泡释放其内含物使这些物质嵌入乳突的表面，但随着乳突的完全形成，细胞质聚集体就会分散，使乳突呈现一个完整的视图[86，91]，乳突的形成有助于阻止白粉菌吸器的形成从而阻止病原菌的侵入，证明乳突的形成有抵抗白粉菌的作用[92]。

3.1.3 乳突的成分分析 植物的表皮细胞壁迅速加厚从而形成坚硬的乳突结构并产生抑菌成分，防止白粉菌的进入，抵制白粉菌的初侵染，乳突是在病原菌入侵位点的细胞壁和原生质膜间积累的半球状体，并有物理和化学2种抗性，研究得最多的是物理抗性，即机械抵抗性和不通透性[16]。乳突特定的组成成分在不同植物中存在差异，通常发现一些类型的化合物，包括酚类、水解酶类、活性氧、细胞壁蛋白和细胞壁聚合物。在这些聚合物中，1，3-β-葡聚糖胼胝质是最丰富和普遍存在的组分之一，但胼胝质的作用仍不清楚[93-94]。Hückelhoven等认为，乳突渗透阻力与H2O2在这些沉积物中的高度局部积累有关[95]；Aist等认为，在mlo基因型的乳突中存在光吸收成分，其富含苯丙素和碱性染色成分，可能是mlo基因抗性机制的分子组分，但迄今为止还没有发现和确定哪种物质是乳突抗性的决定因素[96]。直到最近，还没有一种直接化学分析乳头的方法可用，主要是因为它们非常小并且牢固地固定在植物细胞壁上[97]。

乳突在易感或抗白粉病的植物中都存在，只是在具有抗性的植物体中的乳突更大[70]。Kunoh等研究证明，乳突中存在Ca、P、K和Si等无机元素，并含有大量的低分子量元素，例如C、H、O和N等，这些无机元素是被选择性地沉积到乳突中，而且随宿主细胞的处理不同而变化。正常大小且几乎不具有对白粉菌抗性的乳突中，其主要成分是Ca和K 2种元素，相反，过大且具有白粉病抗性的乳突中，主要含有Ca和P元素，证明磷酸钙与白粉菌的抗性有关，因此高水平的Ca和P暗示磷酸盐抑制水平的存在，可使得过大乳突具有抗性[97]。

3.2 叶肉细胞中MLO基因的抗病调控

叶绿体对植株抗病性的调控有着重要作用。叶绿体的存在能够防止细胞衰老和为病原菌提供营养。超微结构研究结果表明，病原菌通过诱导植物感病品种叶肉细胞中新叶绿体的不断产生来减缓叶肉细胞衰老，同时发现野生型MLO植株的叶肉细胞叶绿体中的2种光合作用标志酶的含量始终保持较高的水平，强的光合作用为病原菌的发育提供营养[18，98]。由此推测叶肉细胞可能是通过营养供给的方式调控表皮细胞的抗病性，叶肉细胞为表皮细胞提供了直接的养分来源，病原菌吸收叶肉细胞输送到表皮细胞中的营养就可以完成其无性循环，植物从而表现为感病性，这种推测与Koga等的观点相吻合，即在大、小麦中与叶肉细胞相接的短型细胞具有较强的感病性，而位于维管束上方，不与叶肉细胞相接的长型表皮细胞则具有较强的抗病性[99]。大麦mlo突变体植株，最先坏死的是叶肉细胞，添加外源单糖有助于延缓叶肉细胞的死亡，因此病原菌导致的mlo突变体植株叶肉细胞的死亡可能与其养分被病原菌大量吸收有关[17]。由此推测，因为野生型叶肉细胞中有持续的营养物质，促进病原菌发育的同时也维持了叶肉细胞的存活。赵淑芳等认为，叶绿体的死亡可能为钙调素所调控[76]，由于MLO蛋白没有定位于叶绿体中，说明MLO蛋白不直接作用于叶肉细胞，而是通过间接的方式来调控防御机制的[17]，关于MLO蛋白如何调控叶肉细胞代谢从而影响防御机制尚且没有足够的研究来证明。

大量研究发现，细胞的死亡与细胞内积累过量的H2O2有关[100-101]。Piffanelli等研究发现，mlo基因型叶肉细胞在H2O2激增后，叶肉细胞受到不可逆的损伤随之发生细胞死亡，这2个反应均受MLO和ROR的控制，但没有证明这2种反应是否有联系，而野生型中MLO蛋白能够抑制叶肉细胞的H2O2激增以及叶肉细胞的死亡[66]。Kumar等通过叶肉细胞H2O2大量存在与清除H2O2的对比试验推测，叶肉细胞的死亡是由于病原菌产生的毒素致使细胞对氧化过程控制的丧失结果，不是细胞程序性死亡，认为H2O2的大量存在破坏了叶绿体从而引起叶斑病并导致坏死叶肉细胞的死亡，而MLO基因型植株能抑制H2O2的激增，也因此抑制了叶肉细胞的死亡[67]，闫亚杰等发现，活性氧积累得越多，细胞膜系统也损坏得更为严重[102]。

总的来说，叶肉细胞可能是通过营养供给的方式调控表皮细胞的抗病性，叶绿体能够为白粉菌和叶肉细胞提供营养，从而维持白粉菌的发育和叶肉细胞的存活，MLO蛋白能够抑制氧化暴发来抑制叶肉细胞的死亡，而氧化暴发又主要集中于叶绿体上[67]，那么MLO调控叶肉细胞的代谢和MLO调控氧化暴发是否存在关系？相关证据尚且不足，MLO蛋白是否还参与叶肉细胞中的其他反应也无从论证。Piffanelli等认为，自发的细胞死亡与突变体叶片的加速衰老有关，在衰老期间叶绿素含量下降[66]，可以猜想这种自发性叶肉细胞死亡是由叶肉细胞的营养转移或叶绿素含量的下降从而导致叶肉细胞养分的丢失而造成的。

赵淑芳还提出了另一个类似于上述通过持续供给病原菌营养使得植物感病的发病机制，发现野生型MLO植株伴胞中较高的CaM含量有利于病原菌的发育，而伴胞有助于植物组织中有机营养的运输，推测野生型MLO植株的有机物质可以迅速进行再分配，进而有利于吸器吸收营养而发育，从而抑制了植物的抗性[18]。但其并没有表明钙调素与伴胞中这种代谢的再分配之间的相关性。

4 MLO基因的应用和展望

白粉菌能够寄生在大量单双子叶植物中，危害植物的生长发育，传统上人们主要通过喷洒农药防治白粉病，或培育具有R基因的抗病品种，但是长期以来白粉菌能够产生对农药和R抗性的抵抗从而筛选出新的白粉菌生理小种，因此这2种抗病方式不适合应用于植物长期的抗病中。野生型MLO植物能够促进白粉菌的入侵，但其突变体mlo植物具有对白粉菌持久而广谱的抗性，利用MLO基因培育抗病品种具有重要的意义，大量研究表明，mlo基因具有多效性，因此在培育抗病品种的过程中，需注意克服MLO突变带来的其他生理反应，培育高抗或完全抗性的品种还需注意MLO基因存在功能冗余的现象，以培养出所需的表型。目前国内外主要研究MLO基因及其所编码蛋白的结构特征、功能和抗病机制，虽然发现MLO蛋白的抗病性与2个高度保守的结构域有关，但是还没有发现或者确定MLO蛋白的抗病性为哪一区域所调控，不同分支的MLO基因存在不同的功能，至今第Ⅳ、Ⅴ分支上MLO基因研究得最多，其他分支的基因功能可做进一步的研究，完善MLO基因的功能研究。目前，人们的主要研究方向为表皮细胞和叶肉细胞里的抗病性机制、MLO基因调控这2个细胞的抗病反应，但是该基因如何调控这些抗病反应过程还未知，还有乳突起抗病作用的物质也有待确定，抗病机制的研究还不成熟。