山羊MC1R基因克隆、表达及其多态性研究

李隐侠， 张 俊， 钱 勇， 孟春花， 王慧利， 钟 声， 曹少先

(江苏省农业科学院畜牧研究所/江苏省农业种质资源保护与利用平台，江苏南京 210014)

MC1R(melanocortin-1 receptor，MC1R)基因，也称促黑素细胞激素受体(MSHR)基因，在哺乳动物中由毛色扩展(extension)位点编码，为G蛋白偶联受体黑素皮质素受体(melanocortin receptors，MCRs)超家族成员之一，只有1个编码区，编码蛋白有7个跨膜结构域[1-2]。研究表明，MC1R基因是控制动物黑色素合成的重要基因，其与编码刺鼠信号蛋白(Agouti)的基因一起调控动物色素合成的数量和分布，从而对动物的毛色形成起到非常重要的作用[3-4]。

研究表明，MC1R基因位点的多态性与哺乳动物包括大鼠[2]、牛[5]、马[6]、猪[7]、绵羊[3]、山羊[8]毛色变异都有很大的相关性。在家畜中，沼泽水牛与白沼泽水牛在476、618、881、930、931 bp位点上分别发生了T/C、G/C、G/A、G/A、A/G突变，导致沼泽水牛和白沼泽水牛第159位氨基酸由丝氨酸变成苯丙氨酸，第310位氨基酸由谷氨酸变成丙氨酸，第294位氨基酸由天冬氨酸变成丙氨酸，发生了非同义突变[5]。在绵羊中MC1R位点鉴定出2个等位基因ED和E+[9-10]，Vage等研究表明，MC1R中 p.M73K 和p.D121N位点是控制黑色性状显著的等位基因位点(ED)，它们的突变导致绵羊黑色表型的形成[11]；在杜洛克猪中的研究表明，A240T突变与其红色毛色相关[12]，Fontanesi等在6个不同毛色的山羊中共检测到MC1R基因5个单核苷酸突变，并且发现MC1R基因可能决定了真黑色素和褐色素的表型[13]。

研究表明，MC1R基因表达量与动物被毛颜色及肤色存在关联。林宇纾等研究发现，MC1R基因在摩拉水牛、沼泽水牛和黄牛皮肤组织中的相对表达量均显著高于白沼泽水平，且白沼泽水牛MC1R基因的编码区发生氨基酸位点突变，推测白沼泽水牛体内合成的黑色素缺失而导致毛色白化[5]；何蕊纯等研究了MC1R基因在3种色型乌苏里貉皮肤组织中表达发现，MC1R基因在野生型乌苏里貉皮质组织中蛋白表达量显著高于红褐色和白色型，说明MC1R在乌苏里貉皮组织中的表达量与乌苏里色型间存在一定的相关性[14]。在羊驼中，棕色皮肤中MC1R基因的表达量远高于白色被毛，且差异极显著[15]。

苏淮山羊是波尔山羊和徐淮山羊的杂交后代，采用传统杂交育种技术和现代分子辅助育种技术相结合，培育出白色被毛、繁殖力高、生长速度快、适应性强的肉用山羊新品种，目前已横交第2个世代[16]。本研究以苏淮山羊和波尔山羊为研究对象，分析MC1R基因在山羊中的序列特征，挖掘在2种不同毛色山羊中MC1R基因SNPs位点差异及表达量的差异，为白色苏淮山羊的进一步选育提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

130只白色苏淮山羊和100只波尔山羊由江苏省农业科学院六合动物实验基地统一饲养管理，营养及管理水平保持一致。每个个体采集耳组织样，置液氮中带回实验室，-80 ℃ 保存。组织样DNA的提取采用酚/三氯甲烷抽提法，TE缓冲液溶解后-20 ℃保存备用。RNA提取试剂盒提取RNA，TaKaRa一步法逆转录cDNA备用。

1.2 PCR扩增

根据GenBank数据库中山羊MC1R基因序列(序列号为FM212940)，采用Primer Premier 5.0软件设计引物P1，扩增苏淮山羊MC1R基因编码区全序列。以苏淮山羊DNA池为模板进行PCR扩增，引物退火温度和片段长度见表1。PCR反应总体系20 μL，含模板DNA 60 ng、Taq聚合酶(5 U/μL)0.2 μL、dNTP(10 mmol/L)0.5 μL、引物(100 μmol/L)各 0.5 μL、MgC12(25 mmol/L)1.4 μL、10×缓冲液2 μL，添加灭菌双蒸水至 20 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。

表1 引物序列及PCR反应参数

1.3 实时定量荧光PCR

根据GenBank数据库中山羊MC1R基因序列(序列号为FM212940)和绵羊GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶，序列号为AF030943)，采用Primer Premier 5.0软件设计引物P2和GAPDH，以看家基因GAPDH为内参，实时定量荧光PCR方法检测MC1R基因在2种山羊耳组织中的表达水平。反应总体系20 μL，含模板DNA 60 ng、SYBR Premix ExTaqⅡ 10 μL、引物(100 mol/L)各0.8 μL，添加灭菌双蒸水至20 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性 5 min；95 ℃变性10 s，60 ℃ 30 s，35个循环。

1.4 SNP筛选

PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，切胶后用DNA胶回收试剂盒回收目的DNA片段，直接送往上海捷瑞生物公司测序。根据序列峰图，筛选出SNPs。

1.5 数据分析

利用SPSS 11.5软件中的One-Way ANOVA统计不同组织中表达量的差异水平。

2 结果与分析

2.1 苏淮山羊MC1R基因扩增及序列分析

以苏淮山羊DNA池为模板对MC1R基因进行PCR扩增，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测发现扩增效果良好(图1)，切胶回收后直接进行测序。测序结果显示，扩增片段长度与预期结果一致，全长1 127 bp。

将扩增获得序列与引物源序列进行比对，通过DNA STAR软件分析得到苏淮山羊MC1R基因的编码区全序列954 bp，编码317个氨基酸残基。通过DNA MAN序列比对发现，2个品种山羊MC1R基因编码区核苷酸序列和氨基酸序列的一致性分别为99.79%和98.77%；核苷酸c.676 A>G突变和 c.701A>G 突变分别导致了氨基酸由谷氨酸到赖氨酸的变化和甘氨酸到天冬氨酸的改变(图2)。苏淮山羊MC1R基因与人类、小鼠、大鼠、牛、猪和绵羊的核苷酸一致性分别为 85.57%、79.65%、81.62%、96.05%、86.63%和98.55%，氨基酸的一致性分别为81.60%、75.15%、78.22%、95.09%、82.07%和98.16%，与家禽类核苷酸和氨基酸的一致性为73.52%和61.66%，说明MC1R基因序列在哺乳动物中的保守性较好。2个不同山羊品种MC1R基因序列中A、T、C、G 4种碱基的平均含量分别为14.8%、22.3%、36.6%、26.3%，其中A+T为37.1%，G+C为62.9%，可见AT含量远低于GC含量。

2.2 哺乳动物MC1R系统发育分析

以家禽为外类群，采用MEGA 4.1软件中NJ法构建了哺乳动物MC1R基因编码蛋白(表2)的系统发育树， 结果(图3)发现聚类结果与经典分类学结果基本一致。2个山羊品种与7个哺乳动物聚在一起，而外类群家禽自成一类；在哺乳动物中，偶蹄目中的2个山羊品种、1个绵羊品种与牛聚在一起[自举率(BP)=100%]，后再与猪聚为一类(BP=72%)；啮齿目中的大鼠和小鼠聚为一类(BP=100%)，而灵长目中的人类和黑猩猩聚为一类(BP=100%)。在偶蹄目中，牛科中的2个山羊品种与绵羊先聚在一起(BP=90%)后与牛聚为一类(BP=100%)，猪科中的猪单独聚为一类。在灵长目中，人科中的人和黑猩猩聚为一类(BP=99%)。

表2 部分哺乳动物MC1R氨基酸序列信息

2.3 MC1R基因在山羊耳组织中表达水平

为进一步研究MC1R基因在山羊毛色中的作用，用实时定量荧光PCR方法检测MC1R基因在白色苏淮山羊和红棕色波尔山羊耳组织中的表达水平。由图4可知，红棕色耳朵的波尔山羊的MC1R表达水平高于苏淮山羊，但是差异并不显著(P>0.05)。

2.4 山羊MC1R基因编码区SNPs筛选和分析

以2个山羊品种(波尔山羊和苏淮山羊)DNA池为模板，利用引物P1对MC1R基因编码区进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测回收后直接进行测序。根据测序峰图，在2个山羊品种MC1R基因编码区中共发现3个SNP位点，苏淮山羊群体中发现2个SNPs位点，即183C/T和748T/G(图5-A、B)，波尔山羊群体中发现了1个SNPs位点，701G/A(图5-C)，其中748T/G位点突变引起了苯丙氨酸到颉氨酸的突变，701G/A位点突变引起了甘氨酸到天冬氨酸的改变。

3 结论与讨论

MC1R基因是1个编码7次跨膜蛋白的G蛋白受体，被认为是动物毛色和皮肤颜色变化的重要候选基因，可与内源配体促黑激素或者刺鼠信号蛋白结合，调节动物的毛色和肤色[4，17]。

本研究以白色被毛的苏淮山羊和红棕色头颈部的波尔山羊为研究对象，苏淮山羊是利用波尔山羊和徐淮山羊杂交后代，采用传统杂交育种技术和现代分子辅助育种技术相结合，培育出白色被毛、繁殖力高、生长速度快、适应性强的肉用山羊新品种[16]。本研究得到苏淮山羊和波尔山羊MC1R基因编码区长度954 bp，编码317个氨基酸残基，同源性比对发现MC1R基因在哺乳动物间相对保守，与绵羊的氨基酸序列一致性最高，为98.16%，牛的次之(95.09%)，与鸡的同源性仅为61.66%。在苏淮山羊和波尔山羊品种间核苷酸的一致性和氨基酸的一致性都很高，分别为99.79%和98.77%；核苷酸c.676的A>G突变和c.701A>G突变分别导致氨基酸由谷氨酸到赖氨酸的变化和甘氨酸到天冬氨酸的改变。波尔山羊的红棕色耳朵和苏淮山羊白色耳朵是1对不同的毛色性状，而本研究发现苏淮山羊和波尔山羊间MC1R基因编码区有2个可以引起氨基酸改变的SNPs位点存在，这可能与二者之间毛色不同的性状相关。

以前的研究表明，MC1R基因的表达量与动物的被毛和肤色存在一定的关联[18]。本研究在2种山羊不同被毛的耳组织中MC1R基因表达水平也存在差异，红棕色波尔山羊的表达水平高于白色苏淮山羊表达水平，虽然差异不显著，但也可在一定水平上反映不同毛色间MC1R基因表达水平是不同的，这与林宇纾等的研究结果[5]一致。这些结果间接说明MC1R基因可能参与苏淮山羊白色被毛形成的分子调控。

到目前为止，关于MC1R多态性与动物毛色关联性的研究很多，在哈萨克绵羊中发现MC1R基因T218A突变(p.M73K)的AB基因型与不同被毛颜色显著相关[18]；Fontanesi等在对波尔山羊的研究中发现，MC1R基因第226个核苷酸位置由赖氨酸向谷氨酸的转变与波尔山羊头部和颈部的红色毛有关[13]；本研究中在波尔山羊和苏淮山羊群体MC1R基因编码区筛选到3个SNPs位点，其中183C/T和748T/G只存在于白色被毛的苏淮山羊群体中，701G/A位点仅存在于棕色头部的波尔山羊群体中，在白色被毛的苏淮山羊群体中未见该突变位点，说明波尔山羊中701G/A位点可能与其棕色头部被毛有关，这些位点是否与山羊毛色形成有关联还需要更多毛色的山羊进行进一步的验证。