郁金根乙醇提取液对KM小鼠慢性肝损伤的研究

张旭冉，刘悦侠，韦柳姿，麦洪华，林礼浩，辛文成，蓝 妮，李晓彤，李 津，姜 艳，梁凌玲 (.右江民族医学院临床医学院,广西 百色 5000;.右江民族医学院科技处实验动物中心,广西 百色 5000;.右江民族医学院科学实验中心,广西 百色 5000；.右江民族医学院科技处，广西 百色 5000)

慢性肝炎是由诸多因素引发的一组肝病症状，将会对患者的机体健康与正常生活造成严重的不良影响,因此需要采取有效的药物进行治疗[1]。目前临床医师主要使用干扰素治疗,能够获得显著的治疗效果[2],但经过诸多临床实践可知,干扰素会在较大程度上导致患者产生不良反应[3]。很多慢性肝炎是由于长期的(大于6个月)肝损伤得不到有效的治疗造成的。郁金的功效为活血止痛，行气解郁，利胆退黄，且可以凉肝降气，故在肝病治疗中运用十分广泛[4]。根据实验用四氯化碳(CCl4)溶于食用油建立慢性肝损伤动物模型[5]。笔者借鉴其方法，通过实验得出腹腔注射4%的CCl4造模效果最佳，在小鼠死亡率为零的基础上，提高了造模率。张婉娴等用郁金水煎液对CCl4急性肝损伤小鼠模型灌胃给药,发现郁金可影响凋亡基因53和capase-3蛋白的表达、阻碍肝细胞凋亡，对CCl4致小鼠急性肝损伤有一定的保护作用[6]。故笔者在此基础上检测郁金根提取液对慢性肝损伤小鼠MAPK信号通路中p38的表达量的影响。

1 材料

1.1仪器：RE-3000A 型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，ALPHA1-2 /LD-Puls 型冷冻干燥机(德国 CHRIST),FA1104 型电子分析天平(上海天平仪器厂),DHG-9070A 型电热恒温旋风干燥箱(上海精密设备有限公司),HHS-21-4型电热式恒温水浴锅(江苏金坛宏凯仪器厂),SHB-Ⅲ型循环水真空抽气泵(上海嘉鹏科技有限公司)。

1.2药品：CCl4，郁金根(采于广西百色市郊),南京建成：谷草转氨酶测试盒(C010-2-96T)、 谷丙转氨酶测试盒(C009-2-96T)，阿拉丁Fenofibrate ≥98%(F129682)，Solarbio：Tris-甘氨酸电泳液(T1070)、高效RIPA裂解液及配件PMSF(R0010)，Thermo 彩虹蛋白marker(26616)，碧云天：BCA蛋白浓度测定试剂盒(增强型P0010S)、 SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒(P0012AC)、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(P0015)、 QuickBlockTMWestern封闭液(P0252)、QuickBlockTMWestern二抗稀释液(P0258)、QuickBlockTMWestern一抗稀释液(P0256)，BeyoECL Plus(超敏ECL化学发光试剂盒P0018S)。

1.3动物:雄性SPF级昆明(KM)小鼠，体重22±2 g。由湖南天勤公司提供，生产许可证号：SCXK(湘)2017-0011。

2 方法

2.1分组：取72只雄性小鼠，按随机原则分成六组，每组12只，分别标记为空白组、模型组、阳性对照组、郁金高浓度组、郁金中浓度组、郁金低浓度组。

2.2造模：将CCl4与食用油按4∶100的比例配成4%的CCl4溶液，除了空白组外的所有组小鼠腹腔注射4%的CCl4溶液进行造模，空白组注射0.9% NaCl溶液，按照10 ml/kg，每3天注射一次，连续造模8周，出现腹水。每组随机抽取2只小鼠进行AST和ALT的检测，可以检测出注射4%的CCl4溶液的小鼠的AST和ALT比空白组的明显升高，说明造模成功。

2.3郁金根乙醇提取液的制备:将新鲜的郁金根用清水洗净，阴干，粉碎至粉末。称取郁金根干粉100 g，按料液比 1∶10加入85%的乙醇溶剂，按下述方法进行提取。75℃恒温水浴加热回流提取2次，每次2小时，抽滤，合并滤液，用旋转蒸发仪减压浓缩至25 ml(相当于生药4 g/ml)，4℃保存，给小鼠灌胃时用0.9% NaCl溶液分别配制成2 g/ml、1 g/ml的药液。

2.4给药方法:按照空白组(0.9% NaCl)、模型组(0.9% NaCl)、阳性对照组(0.02 g/ml Fenofibrater溶液)、郁金高浓度组(4 g/ml郁金根提取液)、郁金中浓度组(2 g/ml郁金根提取液)、郁金低浓度组(1 g/ml郁金根提取液)给药，按小鼠的体重计算灌胃量(10 ml/kg)，1次/d，常规喂养，连续观察14 d，此期间小鼠腹水逐渐减少，无死亡。

2.5检测:

2.5.1对所有组的小鼠进行眼球采血，冰上静置2 h，4℃、12 000 r/min离心10 min，取上清，用谷草和谷丙转氨酶试剂盒检测AST和ALT的变化值。

2.5.2小鼠肝脏蛋白用Western blot检测p38表达量,曝光p38目的条带，用ImageJ软件对曝光的条带的相对灰度值进行计算并统计。

3 结果

3.1郁金根乙醇提取物对小鼠血清ALT和AST的影响：6组之间两两比较差异有统计学意义(P<0.05)，与空白组相比，模型组的AST/ALT活性显著升高(P<0.05)，郁金高、中、低浓度组的AST/ALT活性显著降低(P<0.05)；与模型组相比，阳性对照组、郁金高、中、低浓度组的AST/ALT活性显著降低(P<0.05)；与阳性对照组相比，郁金高、中、低浓度组的AST/ALT活性显著降低(P<0.05)。结果见表1。

表1 郁金根乙醇提取物对小鼠血清ALT和AST的影响

注:与空白组相比，①P<0.05;与模型组相比，②P<0.05；与阳性对照组相比，③P<0.05

3.2不同组别的p38表达Western blot结果：见图1。6组之间两两比较差异有统计学意义(P<0.05),与空白组相比，模型组的p38的表达量显著升高(P<0.05)，郁金高、低浓度组的p38的表达量降低(P<0.05)；与模型组相比，阳性对照组、郁金高、中、低浓度组的p38的表达量降低(P<0.05)；与阳性对照组相比，郁金高、中、低浓度组的p38的表达量降低(P<0.05)。结果见表2。

注：A.空白组；B：模型组；C：阳性对照组；D：郁金高浓度组；E：郁金中浓度组；F：郁金低度组图1 不同组别小鼠p38蛋白Western印迹结果图

表2 不同组别小鼠肝脏p38蛋白的表达量

注:与空白组相比：①P<0.05，与模型组相比，②P<0.05;与阳性对照组相比，③P<0.05

3 讨论

在中医上，郁金作为活血化瘀药物，常常与其他药物配伍用于治疗各种肝脏疾病[7]。药物性肝炎是指使用一种或多种药物之后，由药物或其代谢产物而引起的肝脏损伤，随着新药品的增多，其发病率呈上升趋势，对此中西结合疗效显著[8]。

多项研究表明通过服用中药制剂、靶向治疗或者基因敲除的方法可以抑制MAPK信号通路的p38的磷酸化，从而抑制TNF-α和IL-1β的产生，对肝脏损伤起到保护作用[9-14]。通过p38MAPK调控p65 来激活凋亡执行蛋白 Caspase-3是温郁金二萜类化合物C发挥抗炎和抗癌可能的作用机制之一[15]。

本实验结果表明，模型组中血清AST/ALT和肝脏p38含量比正常组升高，说明CCl4导致正常小鼠血清AST/ALT升高及MAPK信号通路中的p38上调。而经过郁金治疗后，小鼠血清AST/ALT、肝脏p38含量有所下降，其中降低血清AST/ALT以高浓度郁金最有效、肝脏MAPK信号通路中p38的下调以中浓度郁金最有效。

综上所述，郁金根乙醇提取液对慢性肝损伤小鼠的治疗机制可能与降低血清AST/ALT和肝脏MAPK信号通路中p38的下调有关。