用Micro-CT评价大鼠骨质疏松合并骨性关节炎模型

巫旭娜 许碧莲 田佳 吴迪生 古剑雄

(1广东医科大学药学院，广东 湛江 524023；2东莞市第八人民医院药剂科；3广东医科大学附属医院)

骨质疏松(OP)是一种以低骨量和骨组织微结构退化为特征的进行性系统性骨骼疾病，最终导致骨质脆性增加和易于骨折〔1〕。OP可发生于不同年龄和性别，但多见于绝经后妇女。骨性关节炎(OA)是一种以关节软骨退化、关节边缘和软骨下骨增生，继而导致关节间隙狭窄为特征的关节慢性退行性疾病〔2〕。OA在中老年人中有较高的发病率，女性多于男性，特别多见于绝经后妇女〔3〕。OP与OA虽各自有着不同的病理变化和病因，但都属于与年龄、性别有关的退行性病变，且绝经后妇女多见。全世界60%的绝经后妇女面临着这两大疾病的威胁〔4〕。因此，如何防治绝经后妇女的OP和OA，是人们亟待解决的问题。然而，在当前的基础实验研究中缺少稳定的OP合并OA的实验动物模型。适合的实验动物模型是作为大规模实验研究的基础，多年以来国内外报道了多种动物模型，然而各种模型的研究仍有待深入〔5，6〕。微计算机断层扫描技术(Micro-CT)是一种非破坏性的三维(3D)成像技术，可以在不破坏样本的情况下清楚了解样本的内部显微结构。本实验采用两侧去卵巢(OVX)和膝关节腔中注射碘乙酸钠(MIA)两种方法相结合建立大鼠OP合并OA模型，并通过Micro-CT来确认评价，为临床上研究OP合并OA提供实验研究基础。

1 材料与方法

1.1动物及药品 18只3月龄雌性SD大鼠，购自广西医科大学实验动物中心(合格证号：SCXK桂2014-0002)，平均体重(246±22)g。适应性饲养1个月，开始实验时平均体重为(300±15)g。MIA购自美国Sigma公司(批号：19148)，viva Micro-CT 40(SCANCO Medical AG，瑞士)。

1.2动物分组及模型制备 18只大鼠随机分为假手术(Sham)组、两侧OVX组、两侧OVX+MIA组，每组6只。大鼠OVX手术在无菌条件下进行，采用戊巴比妥钠25 mg/kg行腹腔注射麻醉，先行背部双侧腰椎旁1.5 cm处，纵行切口进入腹腔，除假手术组仅暴露卵巢不切除，其余组大鼠切除两侧卵巢，结扎卵巢动脉依次缝合肌肉层和皮肤制作OVX的OP模型〔7〕。4 w后在无菌条件下，又用戊巴比妥钠25 mg/kg进行腹腔注射麻醉，用医用酒精消毒关节附近的鼠毛和皮肤，Sham和OVX组大鼠于右膝髌骨下韧带处于关节腔内注入无菌生理盐水50 μl，而OVX+MIA组大鼠用同样的方法于右膝关节腔中注入配制好的MIA溶液50 μl〔8〕。12 w后，将大鼠麻醉并进行心脏取血处死，取右侧股骨和胫骨并用生理盐水纱布和锡纸包裹，于-80℃保存备用。

1.3股骨松质骨Micro-CT测量 解冻右侧股骨，将标本垂直固定于固定器内，使标本骨骺端保持一致的方向，每6个标本放置一层，进行Micro-CT扫描。viva CT40选择的扫描参数：图像矩阵：2 048×2 048×223，整合时间：200 ms，能量/强度：70 kVp、114 μA、8 W，CT值以1 200 mg HA/cm进行校正，0°旋转扫描。扫描完成后，对股骨松质骨分析是从纵切面距离生长板远端1.0 mm处开始、共层厚3.0 mm的松质骨为测量区域进行重组获得3D图像，图像信息为最低阈值170。对骨组织重组的图像进行数据定量分析，可得到以下定量参数值：骨密度(BMD)、连接密度(Conn.D.)、结构模型指数(SMI)、骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)和骨小梁分离度(Tb.Sp)。

1.4胫骨关节面软骨micro-CT测量 解冻右侧胫骨，在胫骨近心端1/3处用低速锯沿着横切面锯断，获得胫骨上段，保留胫骨中段。将胫骨上段关节面浸泡于泛影葡胺显影液，水浴锅加热至37℃，恒温浸泡20 min取出。将一根胫骨垂直固定于固定器内，放入合适的扫描管内，viva CT40选择扫描参数：图像矩阵为2 048×2 048×223，整合时间：200 ms，能量/强度：45 kVp、177 μA、8 W，CT值以1 200 mg HA/cm校正，0°旋转，进行扫描。扫描完成后，对骨组织重组图像进行3D旋转，以确保横向轴与垂直轴对齐，进行定量分析内侧关节面软骨厚度时选取以正中心前后各2.0 mm，共层厚4.0 mm的关节组织为测量区域进行重组三维图像，图像信息为最低阈值170。在对应的关节面测量区域下对软骨层进行3D图像重组。可获得以下定量参数：软骨体积、软骨厚度。

1.5统计学方法 采用SPSS17.0软件进行统计分析。符合正态分布的数据，组间比较使用单因素方差分析，方差齐时采用LSD-t检验，方差不齐时采用TamhaneT2检验。

2 结 果

2.1各组股骨松质骨Micro-CT定量参数的变化 与Sham组比较，OVX组和OVX+MIA组BMD、BV/TV、Tb.N和Conn.D均明显减小(P<0.01)，Tb.Sp和SMI均明显增大(P<0.01)。见表1。

2.2各组股骨Micro-CT的二维(2D)和3D结构图的变化 由图1可见，Sham组大鼠股骨骨小梁连接和分布紧密，骨2D和3D结构完整；OVX和OVX+MIA组的骨小梁数目减少且出现骨小梁多部位缺失、骨2D和3D结构明显破坏。

表1 各组股骨松质骨Micro-CT定量参数的变化

与Sham组比较:1)P<0.01

图1 各组股骨松质骨Micro-CT的2D和3D结构

2.3各组胫骨关节面内侧软骨Micro-CT定量参数的变化 与Sham组比较，OVX+MIA组软骨厚度、软骨体积均明显减小(P<0.05，P<0.01)，而OVX组软骨厚度、软骨体积均无明显差异(P>0.05)。见表2。

表2 各组胫骨关节面内侧软骨Micro-CT定量参数的变化

与Sham组比较:1)P<0.05,2)P<0.01

2.4大鼠胫骨关节面内侧软骨Micro-CT的软骨厚度2D和3D结构图的变化 胫骨内侧软骨Micro-CT的2D结构图中软骨层的绿色面积越大代表该区域软骨厚度越厚，3D结构图中红色越深代表该区域软骨厚度越厚。与Sham组比较，OVX+MIA组软骨厚度明显变薄，而OVX组大鼠软骨厚度稍为变薄。见图2。

图2 各组胫骨内侧软骨Micro-CT的软骨厚度2D及3D结构

3 讨 论

Micro-CT 能够在微米级分辨率下对硬组织进行3D形态定量分析，比2D体视学定量方法更准确、更科学、更全面反映硬组织包括骨在内的一些材料微观结构，能获得真正的各项同性的容积图像，提高空间分辨率〔9〕。Micro-CT不能对软组织如关节软骨直接进行扫描，因为软组织的X射线吸收率比较低。文献报道〔10〕，应用泛影葡胺造影剂结合Micro-CT扫描的方法，从Micro-CT扫描图像中不但能够清晰地看到软骨区域，还可以通过重建方法将软骨整体形态以3D形式呈现出来，可以进行软骨厚度和体积测量。

本研究结果提示，OVX+关节腔内注射MIA制备OP合并OA的大鼠模型是成功的，而单纯OVX不能制备OP合并OA的大鼠模型。文献报道〔11〕，单纯OVX对关节软骨结构和软骨细胞数量没有影响，单纯OVX不能导致OA。但也有研究报道，单纯OVX可导致OA〔12〕。雌激素水平对关节软骨也有影响，在软骨上有雌激素的受体，雌激素缺乏时会使软骨发生退化〔13〕。因此，单纯OVX制备OP合并OA的动物模型，还尚未得到一致的结果。

OVX模型是模拟绝经后OP的经典模型，关节腔内注射MIA是诱导OA常用的动物模型，本实验采用OP模型和OA动物模型相结合的方法直接模拟绝经后妇女OP合并OA大鼠模型。大鼠去卵巢后，雌激素缺乏。雌激素缺乏导致OP的主要机制与多种炎症因子有关包括白细胞介素(IL)-1、IL-6、IL-7、肿瘤坏死因子(TNF)-α和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，当雌激素缺乏时这些炎症因子会分泌增加。这些细胞因子又会诱导破骨细胞形成和促进骨吸收〔14〕。另外，当雌激素缺乏时垂体-衍生促卵泡激素分泌增加，破骨细胞和它们前体具有促卵泡激素的受体，因此增强了破骨细胞的活性〔15〕。骨吸收增强，导致骨重建失衡，虽然耦联骨形成增加，但骨吸收大于骨形成，从而导致OP。

MIA能导致软骨基质的降解和软骨细胞的凋亡〔16〕，引起软骨的降解和丢失、软骨基质的改变、滑膜炎症等类似于人骨关节炎的病变〔17〕。MIA诱导的原代大鼠软骨细胞凋亡主要与活性氧的产生及线粒体介导的 caspase-3活化有关〔18〕，但是其确切的机制尚未明确。本实验结果显示，采用切除大鼠两侧卵巢和膝关节腔中注射MIA制备OP合并OA模型是可行的，通过Micro-CT扫描重建进行评价是可靠的。这一模型为OP合并OA药物防治研究提供基础依据。