血清miR-21、miR-148b、miR-200a、miR-200b在原发性肝癌患者中的表达及临床诊断意义

程松 郭婧澜

(西南医科大学附属医院检验科，四川 泸州 646000)

原发性肝癌(HCC)是常见的消化系统恶性肿瘤，世界标准化发病率和死亡率分别为10.1/10万、9.5/10万〔1〕。我国是肝癌大国，肝癌的发病率和死亡率均高于世界平均水平。目前肝癌尚无早期诊断的敏感方法，发现时多为肝癌晚期。此外，虽然近年来手术治疗、化疗及免疫治疗等均取得了较大进展，但HCC患者的术后复发和转移率仍然较高〔2〕。因而需要深入研究HCC的发生发展机制，为诊断和治疗提供新的生物学标志。微小RNA(microRNAs)是小内源性非编码RNA，有18～25个核苷酸，参与细胞增殖、分化、凋亡等过程的调控〔3〕，目前miRbase数据库中的223个种属中鉴定出28 645个miRNA前体，35 828个成熟miRNA。miRNA可通过影响靶基因表达，调节细胞信号传导途径，从而促进肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移等生物学过程〔4〕。有研究表明与癌旁组织相比，肝癌组织中miR-21及miR-200b表达升高，miR-148b及miR-200a表达降低，高水平表达miR-21、miR-200b，低表达miR-148b、miR-200a是患者预后不良的重要标志〔5～7〕。本研究旨通过研究HCC患者血清中miR-21、miR-148b、miR-200a、miR-200b的表达，分析其与临床病理特征之间的关系，研究其临床诊断意义。

1 资料与方法

1.1一般临床资料 2013年4月至2015年4月于西南医科大学附属医院诊治的93例HCC患者(病例组)的血清标本，并收集临床病理资料。纳入标准：①HCC的诊断符合2001年9月中国抗癌协会肝癌专业委员会广州制定的HCC临床诊断和分期标准〔8〕。②所有HCC患者为初次诊治，手术前未接受过化疗、放疗等治疗。③患者肝肾功能正常，水电解质酸碱平衡。排除标准：①临床病历资料不完整。②患者合并其他恶性肿瘤。③合并严重感染性疾病。年龄33～71岁，平均(41.5±9.7)岁；伴慢性乙型肝炎61例，无慢性乙型肝炎32例。选取同期西南医科大学附属医院收治的48例肝脏良性病变患者作为良性组，其中25例为肝血管瘤，14例为肝囊肿，9例肝脓肿。其中男28例，女20例，年龄34～75岁，平均(38.2±7.1)岁。48例慢性肝病患者作为慢性肝病组，其中乙型慢性肝炎20例，肝炎后肝硬化13例，酒精性肝硬化11例，丙型病毒性肝炎4例。该组男28例，女20例，年龄30～74岁，平均(39.5±8.4)岁。以50例同期健康体检的正常人血清标本作为对照组，其中男29例，女21例，年龄32～70岁，平均(37.2±7.7)岁。各组性别、年龄无显著差异(均P>0.05)。本研究经医院伦理委员会审核通过，患者及家属均知情同意并已签署知情同意书。

1.2检测方法 所有研究对象入院后第二日清晨空腹采集静脉血5 ml，室温下静置1 h后，1 500 r/min，离心半径10 cm，离心10 min。取上清置于离心管中并保存在-80℃冰箱中待测。采用全自动化学发光免疫分析仪(RocheE710)检测所有研究对象血清中甲胎蛋白(AFP)含量，严格按照试剂盒说明书操作(购自罗氏上海有限公司)，AFP正常值0.0～8.1 μg/L。按照血清总RNA提取试剂盒(QIAGEN，美国)提取血清中总RNA，应用NanoDrropND-1000测定RNA纯度。将提取出的RNA样品置于-40℃冰箱保存。采用miScript逆转录试剂盒(QIAGEN，美国)将miRNA逆转录合成cDNA，反应体系中包括0.5 μg总RNA，4 μl逆转录混合反应液，1 μl反转录酶混合液。合成cDNA后保存于-20℃冰箱。应用SYBR Green PCR试剂盒(QIAGEN，美国)在MX3000P Real-time PCR system(Stratagen,美国)上进行PCR反应。以U6作为内参基因，引物序列如下见表1。反应条件如下：95℃ 10 s，90℃ 5 s，60℃ 30 s，40个循环。用相对Ct值方法分析数据，目的基因的表达相对于内参基因U6的比值为2-ΔΔCt，计算miR-21、miR-148b、miR-200a、miR-200b的相对定量表达水平。

表1 实时定量PCR引物序列

1.3统计学方法 采用SPSS22.0软件进行t检验、χ2检验及受试者工作特征(ROC)曲线。

2 结 果

2.1各组血清中miR-21、miR-148b、miR-200a、miR-200b的表达比较 HCC组血清中miR-21、miR-148b、miR-200a、miR-200b表达分别与肝良性病变组、慢性肝病组及正常对照组相比，差异有统计学意义(均P<0.05)。HCC组血清miR-21与miR-200b表达显著高于良性组(t=2.869、2.524，P=0.007、0.009)、慢性肝病组(t=2.904、2.735，P=0.002、0.003)及对照组(t=3.269、2.897，P=0.001、0.004)，而HCC组miR-200a与miR-148b表达显著低于良性组(t=2.230、2.012，P=0.011、0.011)、慢性肝病组(t=2.869、2.524，P=0.007、0.000)和对照组(t=2.751、2.254，P=0.007、0.026)。见表2。

表2 各组血清中miR-21、miR-148b、miR-200a、miR-200b的表达比较

与HCC组比较：1)P<0.05

2.2HCC组血清miR-21、miR-148b、miR-200a、miR-200b与临床病理特征之间的关系 HCC组血清miR-21与miR-200b表达与病理分期、病理分级及肿瘤直径有关(P<0.05,P<0.01)。血清miR-200a与miR-148b表达与病理分期、病理分级有关(P<0.05，P<0.01)，见表3。

表3 血清四种miRNA与HCC临床特征之间的关系

2.3检测血清miR-21、miR-148b、miR-200a、miR-200b在诊断HCC中的诊断价值 miR-21、miR-148b、miR-200a、miR-200b的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.821、0.668、0.772、0.734，而四项指标联合诊断的AUC为0.922，AFP为0.849，见表4，图1。miR-148b 的诊断准确性较低(0.5

表4 miR-21、miR-148b、miR-200a、miR-200b及联合诊断的诊断价值

图1 miR-21、miR-148b、miR-200a、miR-200b、四项联合诊断及AFP的ROC曲线

3 讨 论

近年来研究表明，细胞内非编码的miRNA调节基因表达，影响细胞信号转导通路，如磷脂酰肌醇3激酶/丝氨酸/苏氨酸激酶(PI3K/AKT)通路、notch信号转导通路等，促进细胞增殖、凋亡等生物学过程〔9〕。miRNA可以与靶基因3′端非偏码区(UTR)的相应靶点结合，改变靶基因mRNA的生物稳定性，诱导mRNA降解或抑制靶基因mRNA的翻译过程，参与调控肿瘤、炎症、免疫反应等多种病理生理过程。肿瘤发生发展过程中，伴有miRNA表达异常，包括表达上调或下调，发挥不同的生物学效应。近年来研究发现在结肠直肠癌〔10〕、神经胶质瘤〔11〕等肿瘤中均存在多种miRNA异常表达的现象。本研究结果与以往研究报道一致〔12〕。HCC中miR-21的作用机制是其靶向重要的肿瘤抑制基因，如磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)，Kazal基序逆向诱导富含半胱氨酸蛋白(RECK)和组织金属蛋白酶抑制剂(TIMP)3等。如RECK可编码调节基质金属蛋白酶(MMP)9的酶，在某些恶性肿瘤中下调表达时，肿瘤细胞侵袭性增强〔13〕。本研究中，HCC患者血清miR-148b表达显著低于肝良性病变组、慢性肝病组及正常对照组。其机制可能与miR-148b对肿瘤细胞增殖信号抑制作用降低有关。有研究表明，miR-148b可影响Met、Wnt1、SMAD2等基因的表达，影响Met/snail和TGFβ-SMAD2信号通路的传导，进而抑制肿瘤细胞的增殖、转移及上皮间质转变(EMT)等过程〔14〕。

miR-200家族分为两个亚家族，miR-200a亚家族包括miR-200a和miR-141，定位于染色体1p36，miR-200b亚家族包括miR-200b，miR-200c，和miR-429，定位于染色体12p13。MiR-200家族的5个成员是EMT的主要调节因子〔15〕。miR-200a表达下调或缺失后，下游靶基因Rho激酶(ROCK)2表达上调，Rho/ROCK信号传导通路的活化可促进肌动蛋白收缩，应力纤维的形成和黏着斑的转换，从而促进肿瘤细胞的转移〔16〕。Rho家族中的小鸟嘌呤三核苷酸磷酸(GTP)酶RhoA及其下游效应子ROCK2的表达增加进一步上调HCC中miR-200b的表达，促进肿瘤的进展和转移的作用。在生理和病理条件下，miR-200亚家族之间是否存在功能性交叉对话，值得进一步研究。

本研究结果表明检测血清中的miR-21、miR-148b、miR-200a、miR-200b的表达水平，可能有助于判断肿瘤分期分化。其原因可能是四种miRNA是调节HCC发生发展过程中的不同信号通路中的关键节点，如miR-21参与抑癌基因的调控、miR-148b参与细胞增殖信号调控，而miR-200a和miR-200b参与肿瘤细胞EMT过程，关键节点的改变将影响肿瘤的增殖、凋亡及迁移等恶性生物学行为。此外，动态检测循环miRNA可以评估患者术后状态，包括肿瘤的复发或转移〔17〕。本研究结果表明，四项指标联合诊断的诊断准确性较高，联合诊断的敏感性和特异性均高于任一单一指标，因而有可能成为临床诊断的新的分子标志物。然而，本研究样本例数较少，并且miRNA表达具有时间和空间特异性，联合检测上述四种miRNA在原发性肝癌的诊断是否稳定并且可重复，有待进一步多中心大样本研究。