三月李及其红肉突变体Aux/IAA家族基因鉴定及分析

方智振 姜翠翠 周丹蓉 潘少霖 叶新福

(福建省农业科学院果树研究所/福建省落叶果树工程技术研究中心,福建 福州 350013)

生长素为植物体内一种十分重要的激素,在果实生长发育的各个阶段发挥着重要的作用[1-3]。植物中生长素信号转导受Aux/IAA(Auxin/Indole-3-acetic acid)、GH3(Gretchen Hagen3)和SAUR(Small Auxin Up RNA)等一系列基因调控[4-5]。其中,Aux/IAA是一类生长素早期诱导表达的原初响应基因[6],在生长素信号转导途径中扮演着重要的角色。Aux/IAA编码的蛋白质定位于细胞核,且半衰期较短[7]。大多数Aux/IAA 蛋白质含有4 个保守的结构域,分别为结构域Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ[3,8]。结构域Ⅰ含有一个可与TOPLESS 互作的亮氨酸重复基序LxLxLx,该基序与Aux/IAA 蛋白质的抑制活性有关[9-10];结构域Ⅱ含有一个能够被TIR1/AFBs 识别的GWPPV 基序,此基序与Aux/IAA蛋白质的不稳定性有关[11];结构域Ⅲ和Ⅳ则负责Aux/IAA 之间或Aux/IAA 与生长素响应因子ARF(auxin response factor)之间的互作调控[12-13]。近年来,研究表明Aux/IAA 家族基因参与植物果实生长发育。Audran-Delalande 等[14]研究发现抑制SlIAA9 表达可导致番茄单性结实,而沉默SlIAA27 或SlIAA17 可使番茄果实大小、形状和品质发生改变[15-17]。此外,Aux/IAA 家族成员在果实成熟过程中也发挥着重要的作用[18-19]。生长素信号转导通过与乙烯信号转导互作参与果实成熟调控,而Aux/IAA 家族基因与二者的互作有关[14,18-19]。可见,Aux/IAA 家族基因在果实生长发育和成熟过程中扮演着多重角色。因此,系统地鉴定和分析Aux/IAA 家族基因,并进一步解析Aux/IAA 家族基因在果实生长发育和成熟过程中的功能具有重要的意义。目前,已从苹果[20]、桃[19]、番木瓜[18]和山核桃[21]等果树中鉴定出Aux/IAA 家族基因,但对李Aux/IAA 家族基因知之甚少。

三月李(Prunus salicinaLindl.Sanyueli)是适合在我国南方地区栽培的早熟黄肉李品种。福建省农业科学院果树研究所李育种课题组采用60Co-γ 对三月李进行辐射诱变,获得了一个迟熟的大果红肉突变体[22],可作为研究果实大小、果肉颜色和果实成熟期等性状调控机制的优良材料,但其果实性状变异形成的分子机制不清楚。前期研究采用RNA-Seq 对不同成熟阶段的三月李及其红肉突变体果肉进行转录组测序,获得了二者果实成熟过程的转录组数据。本研究基于该转录组数据,对李Aux/IAA 家族基因进行生物信息学与表达分析,明确该基因家族序列特征及其在三月李和红肉突变体果实成熟过程中的表达模式,以期为Aux/IAA 家族基因在李(尤其是三月李红肉突变体)果实成熟过程中的功能研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 数据来源及Aux/IAA 家族基因的鉴定

所用李转录组数据为福建省农业科学院果树研究所李育种课题组获得的三月李(盛花后95、105 和115 d)及其红肉突变体(盛花后95、105、115 和125 d)的果肉转录组数据。所有李果实均采自福建省农业科学院果树研究所李种质资源圃。每个阶段分别从同一棵的3 个主枝上各采10 个果,采收时,选择形状、色泽和大小一致的果实。果实采收后迅速运回实验室,将采自同一主枝的果实切成大小相似的小块,混合到一起,用液氮速冻后保存于-80℃冰箱。采自3 个主枝的果实作为生物学重复。

从TAIR 数据库(http:/ /www.arab idops is.org/)下载拟南芥Aux/IAA 家族基因蛋白质序列。以拟南芥和番茄的Aux/IAA 蛋白质序列为查询序列,采用TBtools 的BLAST 工具从三月李及其红肉突变体蛋白质数据库中检索Aux/IAA 家族成员。同时,从Pfam数据库(http:/ /pfam.xfam.org/)下载Aux/IAA 家族的HMM 模型(PF02309),并采用HMMER 3.0 进行Aux/IAA 家族成员的鉴定。

1.2 Aux/IAA 家族蛋白质生物信息学分析

采用ExPASy 的ProtParam 工具(https:/ /web.expasy.org/protparam/)进行PsAux/IAA 家族蛋白质氨基酸理化性质分析;用 subCELlular LOcalization predictor(http:/ /cello.life.nctu.edu.tw/)进行PsAux/IAA 蛋白质亚细胞定位预测。

1.3 Aux/IAA 家族蛋白质保守基序分析与多重序列比对

利用NCBI 保守结构域在线分析工具(http:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml)和MEME(http:/ /meme.sdsc.edu/meme/meme-in.tro.html)进行三月李及其红肉突变体Aux/IAA 家族蛋白质的保守结构域与基序分析,并采用TBtools 进行示意图绘制。利用DNAMAN 7 软件进行PsAux/IAA 的氨基酸序列比对。

1.4 三月李及其红肉突变体Aux/IAA 家族蛋白质系统进化树的构建

利用软件MAGAX 采用邻接法(neighbor-joining,NJ)构建三月李及其红肉突变体26 个Aux/IAA 蛋白质序列系统进化树与29 个拟南芥Aux/IAA 家族蛋白质共同构建系统进化树,Bootstrap 值设置为1 000。采用在线工具iTOL(https:/ /itol.embl.de/)进行Aux/IAA 家族蛋白质进化树的绘制。

1.5 三月李及其红肉突变体Aux/IAA 家族基因的差异表达模式分析

根据三月李及其红肉突变体果实成熟的转录组数据中的FPKM 值(每百万fragments 中来自某一基因每千碱基长度的fragments 数目),分析Aux/IAA 家族基因表达情况,每个阶段的表达量值为3 个生物学重复的平均值。表达量热图采用TBtools 进行绘制。

2 结果与分析

2.1 三月李及其红肉突变体Aux/IAA 家族基因的鉴定及蛋白质特性分析

为了鉴定三月李及其红肉突变体的Aux/IAA 成员,以29 个拟南芥Aux/IAA 成员的蛋白质序列为查询序列,通过BLAST 搜索从三月李及其红肉突变体蛋白质数据库中检索Aux/IAA 蛋白质。同时,采用隐马尔可夫模型进行Aux/IAA 蛋白质鉴定,初步鉴定出38个含有Aux/IAA 结构的蛋白质(表1)。随后,去除含有ARF 家族特征结构域B3 和ARF 的蛋白质,最后共鉴定得到26 个Aux/IAA 家族基因,根据编码蛋白质序列长度依次将其命名为PsIAA1 ～PsIAA26。PsIAA蛋白质序列的长度在165～802 aa 之间,预测蛋白质的相对分子量在18.25 ～88.60 kD 之间,等电点介于5.15～9.56。根据预测的理论等电点,发现三月李及其红肉突变体的Aux/IAA 成员中有14 个酸性蛋白质和12 个碱性蛋白质。蛋白质不稳定系数分析结果表明,除了PsIAA9、PsIAA19 和PsIAA25 为稳定蛋白质,其他PsIAA 蛋白质均为不稳定蛋白质。三月李及其红肉突变体Aux/IAA 家族蛋白质平均亲水系数均为负数,表明26 个Aux/IAA 家族蛋白质均为亲水蛋白质。亚细胞定位预测结果表明,大部分Aux/IAA 家族蛋白质位于细胞核,个别蛋白质位于线粒体、叶绿体和细胞质。

表1 三月李及其红肉突变体Aux/IAA 家族蛋白质的理化性质和亚细胞定位Table 1 Physicochemical properties and subcellular localization of Aux/IAA family proteins from Sanyueli and the red-fleshed mutant

2.2 三月李及其红肉突变体Aux/IAA 家族蛋白质进化分析

由图1 可知,李、桃、番茄和拟南芥Aux/IAA 家族蛋白质可分为两组(A 和B),分别包含5 个(A1 ～A5)和4 个(B1～B4)亚组,且每个桃Aux/IAA 家族蛋白质都有与其配对的李同源序列。A1 亚组的Aux/IAA 家族蛋白质数量最多,共有6 个,分别为PsIAA19、PsIAA20、PsIAA22、PsIAA23、PsIAA24 和PsIAA25;A2-A4、B3 和B4 亚组均含有3 个PsIAA 蛋白质,B1 和B2亚组均含有2 个PsIAA 蛋白质;A5 亚组数量最少,仅含有1 个PsIAA 蛋白质。

2.3 三月李及其红肉突变体Aux/IAA 家族蛋白质保守结构域分析

对PsIAA 蛋白质的保守结构域进行分析,发现24个Aux/IAA 蛋白质均含单一的Aux/IAA 结构域,其中PsIAA1、PsIAA2、PsIAA4 等9 个蛋白质含有Aux/IAA超家族结构域,仅PsIAA25 和PsIAA26 含有其他结构域(图2)。为了进一步研究李Aux/IAA 家族蛋白质的保守结构域,利用在线软件对李Aux/IAA 家族蛋白质进行分析。由图3 可知,李Aux/IAA 家族蛋白质共含有4 个保守基序。A 组除了PsIAA11 存在Motif3 缺失外,其他PsIAA 蛋白质均含有4 个基序;而B 组除了PsIAA17 和PsIAA18 含有4 个基序外,其他PsIAA蛋白质均存在1～2 个基序的缺失。

图1 李、桃、番茄和拟南芥Aux/IAA 家族蛋白质系统进化树Fig.1 Phylogenetic tree of Aux/IAA family proteins from plum,peach,tomato and Arabidopsis

图2 李Aux/IAA 家族蛋白质进化树及保守结构域分析Fig.2 Phylogenetic tree and conserved domain of plum Aux/IAA family

图3 李Aux/IAA 家族蛋白质保守基序及结构域序列LogoFig.3 The conserved motifs and domain sequence Logo of plum Aux/IAA family proteins

为了分析李Aux/IAA 家族蛋白质保守结构域的特征,采用DNAMAN7 对李Aux/IAA 进行多重序列比对分析(图4)。结果显示,大部分李Aux/IAA 家族蛋白质含有4 个保守的结构域(DomainI-DomainIV)。除了 PsIAA1、PsIAA4、PsIAA8、PsIAA9、PsIAA10、PsIAA18、PsIAA21 和PsIAA26,其他PsIAA 蛋白质均含有经典的LxLxLx 基序。此外,大部分李Aux/IAA家族蛋白质都含有2 个核定位信号,分别为位于DomainⅠ和DomainⅡ之间的双组份核定位信号以及位于DomainⅣ的SV40 核定位信号。

2.4 三月李及其红肉突变体果实成熟过程中Aux/IAA 家族基因的表达模式分析

基于三月李及其红肉突变体果实成熟过程的转录组数据中26 个Aux/IAA 家族基因的FPKM 值,分析Aux/IAA 家族基因的表达模式,发现三月李及其红肉突变体果实成熟过程中共有16 个Aux/IAA 家族基因(PsIAA2、PsIAA5、PsIAA6、PsIAA7、PsIAA10、PsIAA11、PsIAA13、PsIAA14、PsIAA15、PsIAA17、PsIAA18、PsIAA19、PsIAA20、PsIAA22、PsIAA23 和PsIAA25)存在差异表达(图5)。PsIAA2、PsIAA5、PsIAA7、PsIAA11、PsIAA13、PsIAA14、PsIAA17、PsIAA22 在三月李及其红肉突变体果肉中的表达量均随着果实的成熟逐渐升高。其中,PsIAA11 和PsIAA13 在三月李果肉中的表达量高于红肉突变体果肉,而PsIAA14 在红肉突变体果肉中的表达量高于三月李果肉。PsIAA18 和PsIAA20 在三月李及其红肉突变体果肉中的表达量均随着果实的成熟逐渐降低。其中,PsIAA18 在红肉突变体果肉中的表达量始终高于三月李果肉。PsIAA15、PsIAA19 和PsIAA25在成熟三月李果肉中的表达量降低,但三者在红肉突变体果实成熟过程中的表达量无明显变化。其中,PsIAA19 和PsIAA25 在红肉突变体果肉中的表达量高于三月李果肉。

3 讨论

生长素是与许多植物生长发育过程密切相关的重要信号分子[23]。Aux/IAA 通过与生长素响应因子ARF 结合参与生长素信号转导途径下游基因表达的调控[24],进而参与果实成熟等植物生长发育过程的调控。目前,已从包括苹果[20]、桃[19]、番木瓜[18]和山核桃[21]等果树在内的多种植物中鉴定出Aux/IAA 家族基因,不同植物Aux/IAA 家族基因成员数量和组成存在一定的差异。本研究从三月李及其红肉突变体果实成熟过程的转录组中鉴定出26 个Aux/IAA 家族基因,少于拟南芥(29 个)[25]和苹果(33 个)[20],但多于番茄[14](25 个)、桃(22 个)[19]、山核桃(22 个)[21]和番木瓜(18 个)[18]。本研究鉴定的Aux/IAA 家族基因成员数量略多于其近缘物种桃,且进化树分析显示,22个桃Aux/IAA 家族蛋白质都可在李Aux/IAA 家族蛋白质中找到同源序列,可见鉴定的Aux/IAA 家族基因成员具有较高的完整性,但三月李基因组中Aux/IAA家族基因成员的准确数量还需通过基因组数据分析进一步确定。

图4 李Aux/IAA 家族蛋白质的多重序列比对Fig.4 Multiple sequence alignment analysis of plum Aux/IAA family proteins

图5 李Aux/IAA 家族基因在三月李及其红肉突变体果实成熟过程中的表达模式Fig.5 Expression pattern of plum Aux/IAAfamily genes during fruit ripening of Sanyueli and the red-fleshed mutant

Aux/IAA 是植物特有的一类转录调控因子。Aux/IAA 通过对不同浓度生长素的响应,与生长素响应因子ARF 互作抑制或激活生长素响应基因的表达,参与生长素信号转导途径[26]。在低生长素浓度条件下,Aux/IAA 蛋白质与ARF 结合抑制下游基因的转录[27-28];在高生长素浓度条件下,Aux/IAA 被降解[26,29]。Aux/IAA 蛋白质通过4 个保守结构域发挥作用。结构域Ⅰ决定Aux/IAA 蛋白质的抑制活性[9]。结构域Ⅱ则为Aux/IAA 蛋白质与F-盒蛋白质TIR1的互作位点,负责参与Aux/IAA 降解的调控[11]。结构域Ⅱ的缺失可导致生长素浓度提高时Aux/IAA 蛋白质无法被快速降解,使其半衰期延长,降低对生长素的灵敏度[30-31]。结构域Ⅲ和Ⅳ是调控Aux/IAA 与Aux/IAA 或ARF 结合形成聚合体的位点[12-13]。本研究鉴定的多个Aux/IAA 蛋白质存在位点的缺失或突变。番茄[14]、番木瓜[18]、桃[19]、苹果[20]和山核桃[21]等植物的Aux/IAA 家族蛋白中也发现了功能位点的缺失或突变。这些位点的缺失或突变均有可能引起Aux/IAA 蛋白质功能的改变,但这些功能位点的缺失或突变对Aux/IAA 蛋白质功能的影响鲜见报道。因此,推测这些存在结构域缺失的李Aux/IAA 蛋白质可能不参与生长素信号转导或在生长素信号转导途径中的功能发生改变,但具体功能还需通过试验进一步验证。

本研究结果表明,在三月李及其红肉突变体果实成熟过程中共有16 个差异表达Aux/IAA 家族基因,说明Aux/IAA 家族基因与李果实成熟过程中密切相关。桃[19]和番木瓜[18]的研究中也发现在果实成熟过程Aux/IAA 家族基因的表达存在活跃的变化。Bassa等[15]研究发现沉默SlIAA27 可使转基因株系的果实显著变小。本研究中,PsIAA19、PsIAA20、PsIAA25 与SlIAA27 蛋白质属于同一个分支,表明它们可能具有类似的功能。前期果实性状比较表明,红肉突变体果实明显大于三月李果实,而本研究结果显示,三月李红肉突变体果肉中PsIAA19 和PsIAA25 的表达量高于三月李果肉中的表达量,推测PsIAA19 和PsIAA25 可能参与果实大小调控。此外,三月李红肉突变体果肉中PsIAA14 的表达量也高于三月李果肉中的表达量,但Su 等[16]发现沉默PsIAA14 同源基因SlIAA27 也可使转基因株系的果实明显变小。此外,PsIAA11 和PsIAA13在三月李果肉中的表达量随着果实的成熟而迅速上升,但在红肉突变体果肉中的表达量始终维持在很低的水平。这两个基因在三月李及其红肉突变体果肉中表达模式的差异是否与其果实成熟期和果肉颜色变异有关及差异表达的形成机制还有待探讨。

4 结论

本研究基于三月李及其红肉突变体果实成熟过程的转录组数据,鉴定出26 个Aux/IAA 家族基因。进化树分析结果表明,李Aux/IAA 家族蛋白质可分为2个组,9 个亚组。结构域预测和多序列比对结果显示,李Aux/IAA 家族蛋白质具有保守的特征结构域;亚细胞定位预测结果表明,大部分李Aux/IAA 蛋白质分布于细胞核。此外,在三月李及其红肉突变体果实成熟过程中共有16 个Aux/IAA基因存在差异表达,且不同成员呈现不同的表达模式。本研究结果可为李Aux/IAA家族基因在果实成熟过程的功能研究提供参考。