琯溪蜜柚果皮中黄酮的超声辅助乙醇提取工艺

晏 幸，钟业渊，胡 阳,2,3，魏好程,2,3，杜希萍,2,3，倪 辉,2,3，陈艳红,2,3

(1.集美大学食品与生物工程学院，福建 厦门 361021；2.福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建 厦门 361021；3.厦门市食品生物工程技术研究中心，福建 厦门 361021)

0 引言

琯溪蜜柚(Citrusgrandis)原产于福建省平和县，是我国著名的柚类水果。统计数据[1]显示，截至2016年底，仅福建省平和县琯溪蜜柚种植面积就达43 333 hm2，年产量120万t，产值超过50亿元。琯溪蜜柚的种植已经成为一种重要的农业产业及农业经济组成，是农民脱贫致富的重要途径[2]。柚皮占整个柚子的43%～48%，是柚子最主要的加工副产物。长期以来，人们主要关注柚子果实的加工利用，却忽略了柚皮的利用[3]，导致大量柚皮丢弃，不仅浪费资源，而且会引起严重的环境污染。随着琯溪蜜柚加工产业不断发展，对其柚皮开展综合利用研究显得十分急迫。

研究[4]表明，柚皮中富含对人体有益的活性成分，如黄酮类化合物、类柠檬苦素、类胡萝卜素、多酚等。黄酮类化合物占柚皮干重的2%～8%[5]，是柚皮的主要成分之一，其中柚皮苷是最主要的黄酮类化合物，约占其黄酮类物质的80%[6]。柚皮苷等黄酮类化合物具有抗氧化、降血压、抗动脉粥样硬化、抗心肌缺血、抗心律失常、抗肿瘤、预防糖尿病等作用[7-11]。在食品工业上，柚皮苷可作为品质改良剂、着色剂应用于食品和风味饮品的生产[12]；在医药工业上，柚皮苷可用于生产防治心脑血管疾病、镇痛、清热及消炎等药物。因此，提取柚皮苷等黄酮类物质是柚皮综合利用的重要途径。

目前，黄酮类化合物提取方法主要有水提法、有机溶剂提取法、微波辅助提取法、超声辅助提取法、酶辅助提取法等[13]，其中，超声辅助提取法与传统提取方法相比，具有速度快、提取率高、温度低、节约溶剂等特点，不受成分极性、分子质量大小的限制，适用于绝大多数有效成分的提取，是一种高效、快速、节能的柚皮黄酮提取技术[14-15]。

本研究以福建省平和县琯溪蜜柚果皮为原料，采用超声波辅助法开展黄酮提取研究，考察各因素对总黄酮和柚皮苷提取量的影响，并测定提取得到的黄酮中柚皮苷的含量，为琯溪蜜柚果皮中黄酮类物质的提取及利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂 琯溪蜜柚购于福建省平和县。芦丁(质量分数≥95.0%)购自国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇(分析纯)购自上海沃凯生物技术有限公司；亚硝酸钠、九水合硝酸铝、氢氧化钠等均为分析纯，购自西陇科学股份有限公司；甲醇、乙腈均为色谱级，购自美国Sigma公司。

1.1.2 仪器与设备 高速粉碎机(JP-500C型)购于永康市久品工贸有限公司；旋转蒸发仪(RE-52AA型)购于上海亚荣生化仪器厂；酶标仪(Epoch 2T型)购买于美国伯腾仪器有限公司；超声波清洗器(KQ5200DE型)购于昆山市超声仪器有限公司；岛津液相色谱仪(LC-20AT型)购于日本岛津。

1.2 实验方法

1.2.1 黄酮提取及分析测定 将琯溪蜜柚清洗除杂后，剥取其果皮，挑选清洗，剪成1 cm2的小块，晒干至柚皮质量不变为止，用高速粉碎机将其粉碎过100目筛。提取分析过程为：柚皮粉→超声辅助提取→真空抽滤→滤液定容→分析测定。

1.2.2 液料比对柚皮黄酮和柚皮苷提取的影响 称取1 g柚皮粉，以体积分数70%乙醇为提取溶剂，分别设定液料比(mL∶g)为5∶1、25∶1、45∶1、65∶1、85∶1 ，在25 ℃、超声频率100 W的条件下超声提取50 min，趁热进行抽滤，收集提取液用超纯水定容至100 mL，测定总黄酮及柚皮苷含量。

1.2.3 提取时间对柚皮黄酮和柚皮苷提取的影响 称取1 g柚皮粉，以体积分数70%乙醇为提取溶剂，液料比(mL∶g)为45∶1，提取温度为25 ℃，超声频率为100 W，分别提取10，30，50，70，90 min，样品超声后趁热进行抽滤，收集提取液用超纯水定容至100 mL，测定总黄酮含量及柚皮苷含量。

1.2.4 乙醇体积分数对柚皮黄酮和柚皮苷提取的影响 称取1 g柚皮粉，在液料比(mL∶g)为45∶1，提取时间为50 min，提取温度为25 ℃，超声频率为100 W条件下，分别采用10%，30%，50%，70%，90%的乙醇进行提取，样品超声后趁热进行抽滤，收集提取液用超纯水定容至100 mL，测定总黄酮含量及柚皮苷含量。

1.2.5 提取次数对柚皮黄酮提取的影响 称取1 g柚皮粉，在液料比(mL∶g)为45∶1、提取时间为50 min、提取温度为 25°C、超声频率为100W、乙醇体积分数为70%的条件下提取柚皮黄酮，将提取液在温度为20 ℃、时间为5 min、转速为5500 r/min的条件下离心取上清液。取第一次提取后的沉淀/残渣按照第一次提取相同的工艺进行第二次提取，得到提取上清液。之后，残渣不断进行重复提取，直至上清液吸光度值与体积分数70%乙醇空白溶液的一样，即代表柚皮中所有黄酮被完全提取出来。按下式计算多次提取得到的黄酮总量：黄酮总量/(mg·g-1)=m1+m2+m3+m4+m5。其中：m1为第1次提取出的黄酮量；m2为第2次提取出的黄酮量；m3为第3次提取出的黄酮量；m4为第4次提取出的黄酮量；m5为第5次提取出的黄酮量，单位均为mg/g。

1.2.6 总黄酮及柚皮苷含量测定方法的建立

1.2.6.1 总黄酮含量测定方法 取5 mL提取液于25 mL比色管中，向其中加入2 mL 体积分数30%乙醇溶液，充分摇匀，加入1 mL质量分数5%的NaNO2溶液，混匀后静置5 min。再加入1 mL质量分数10%的Al(NO3)3溶液，摇匀后放置5 min，然后加入10 mL 质量分数4%NaOH摇匀，加入体积分数30%乙醇定容到25 mL，充分摇匀并静置15 min，测定510 nm的吸光度值，根据芦丁标准曲线按照式(1)[16]计算提取液中黄酮的提取量。其中，测定得到的芦丁标准回归曲线方程Y=1.556 5X+0.012 9。

黄酮提取量X/(mg·g-1)=(C×V1×V2)/(m×V0)，

(1)

式中：C为由回归方程算得的样液浓度(g/L)；V1为测定时的定容体积(mL)；V2为提取液定容体积(mL)；m为称取样品质量(g)；V0为用于测定的提取液体积(mL)。

1.2.6.2 柚皮苷含量测定方法 取10 mL定容后的提取液，旋蒸至干，加入10 mL甲醇并超声波辅助溶解，过0.20 nm滤膜进行液相色谱分析。色谱柱为AlltimaTM C18Column(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为V(超纯水)∶V(甲醇)∶V(乙腈)=62∶12∶26；检测波长为283 nm；流速为0.6 mL/min；柱温为25 ℃，进样量为10 μL，洗脱时间为25 min。根据柚皮苷标准曲线方程Y=27 562.9X-68 552，按下式计算柚皮苷含量：

柚皮苷含量X/(mg·g-1)=cV/(1000m)，

(3)

式中：X为试样中被测组分含量(mg/g)；c为从标准曲线上得到被测组分溶液的浓度(mg/L)；V为样品溶液定容体积(mL)；m为样品溶液所代表试样的质量(g)。

1.2.7 数据处理方法 应用Office Excel 2013进行统计学分析，利用SPSS 19.0软件中的单因素中的Duncan检验进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 液料比对柚皮中黄酮和柚皮苷提取的影响

由图1可知，总黄酮和柚皮苷的提取量随着液料比升高而增大，并在液料比(mL∶g)为45∶1时达到最大值，总黄酮和柚皮苷的最大提取量分别为30.44和19.56 mg/g。但随着液料比进一步升高，总黄酮提取量趋于稳定。相关文献[17]表明，增大溶剂量会导致黄酮类化合物分子传质到溶液中的总量增加，当提取物达到平衡后，继续增大溶剂量会增加杂质的浸出。因此，柚皮黄酮提取选择液料比(mL∶g)为45∶1比较合适。此外，当液料比(mL∶g)大于45∶1时，对黄酮提取量无显著性影响(P≤0.05)，柚皮苷提取量随提取液料比增加而缓慢降低(P≤0.05)。倪明等[18]采用超声波微波组合提取柚皮总黄酮，其优化的液料比(mL∶g)为80∶1，乙醇体积分数为90%，超声波功率为300 W，微波功率为900 W，提取时间为2 min。刘英等[19]采用超声辅助提取柚皮中柚皮苷，优化的液料比(mL∶g)为30∶1，提取时间为1 h，乙醇体积分数为50%，提取温度为50 ℃，提取功率为25 W。对比相关文献，本实验的液料比小于文献[18]的研究结果，但大于文献[19]的结果。

2.2 提取时间对柚皮黄酮和柚皮苷提取的影响

由图2可知，随着提取时间的增加，总黄酮和柚皮苷提取量增大，在提取时间为50 min时达到最大，总黄酮和柚皮苷的最大提取量分别为29.05和20.76 mg/g。但随着时间进一步延长，总黄酮和柚皮苷提取量呈现下降的趋势。当提取时间为50 min的时候，黄酮提取量最大，继续增加提取时间，黄酮提取量显著降低(P≤0.05)。柚皮苷提取量随提取时间的变化规律与黄酮提取量变化规律相同。陈文娟等[20]采用热浸提法提取漳州血柚皮中的总黄酮，最优提取时间为2.5 h。郭俊俊等[21]使用乙醇浸提法提取柚皮中的黄酮类化合物，最优提取时间为2 h。谢勇武等[22]采用植物纤维素酶提取柚皮中总黄酮，最优提取时间为90 min。公衍玲等[23]采用乙醇回流法提取柚皮中总黄酮，得到的最优提取时间为95 min。很显然，本研究的提取时间远远低于以上相关研究报道的柚皮黄酮提取时间，其原因可能是本实验采用了超声辅助提取，缩短了黄酮提取时间。

2.3 乙醇体积分数对柚皮中黄酮和柚皮苷提取的影响

由图3可知，随着乙醇体积分数的增高，总黄酮和柚皮苷提取量先增大而后变小，在乙醇体积分数为70%时，总黄酮和柚皮苷提取量达到最大，分别为30.12和19.15 mg/g。在乙醇体积分数为70%～90%的范围内，柚皮总黄酮提取量随着乙醇体积分数增大而逐渐减小，这可能是由于乙醇体积分数不断增加，柚皮黄酮类化合物的溶解度变小所致。当乙醇体积分数为70%时，黄酮和柚皮苷的提取量显著高于其他乙醇体积分数的提取量(P≤0.05)。

魏强华等[24]在乙醇体积分数为70%、液料比(mL∶g)为20∶1、提取时间为60 min、提取温度为40 ℃的条件下从柚皮中提取柚皮苷，平均提取量为33.80 mg/g。于桂香等[25]在乙醇体积分数为82%、超声时间为45 min、提取温度为61.5 ℃的条件下提取柚皮黄酮，提取率为6.667 mg/g。马亚琴等[26]在甲醇体积分数为80%、温度为40 ℃、超声功率为8 W、超声时间为30 min、液料比(mL∶g)为20∶1的条件下提取柚皮中的柚皮苷，提取率约为5%。相比之下，本实验的乙醇体积分数低于大部分研究优化的结果。

2.4 提取次数对总黄酮的影响

表1 提取次数对琯溪蜜柚果皮中黄酮的影响Tab.1 Effect of repeat times on extraction rate oftotal flavone from Guanxi honey pummelo peel提取次数Extraction times黄酮提取量/(mg·g-1) Extraction amount of flavone黄酮提取率/%Extraction rate of flavone132.37±0.1945.79±0.005214.59±0.3720.65±0.004312.02±0.4917.01±0.002411.70±0.1916.56±0.001500柚皮中总黄酮提取量Total flavone extractedfrom pomelo peel70.69±0.98—

在液料比为45∶1、提取时间为50 min、乙醇体积分数为70%的条件下对柚皮中的黄酮进行多次重复提取，结果如表1所示。可见，第1次黄酮提取量为32.37 mg/g，之后，每次提取量随提取次数增加而逐渐下降，至第5次提取时，提取液中已经检测不出黄酮类物质。计算前4次琯溪蜜柚果皮中黄酮提取量为70.69 mg/g，约占柚皮7.07%。王晓君等[27]采用微波辅助复合酶法提取脐橙皮中的总黄酮，每100 g得到的黄酮提取量为3.96 g(约3.96%)；公衍玲等[23]在乙醇体积分数为76%、液料比为20∶1、回流提取为2次、回流时间为95 min、回流温度为90 ℃的条件下提取柚皮黄酮，得率为1.036%。相比之下，本实验从琯溪蜜柚果皮中提取得到的黄酮得率远高于其他柚类黄酮的提取得率。

2.5 琯溪蜜柚黄酮提取物中柚皮苷含量的分析

采用HPLC测定琯溪蜜柚提取物中柚皮苷含量，色谱图如图4所示，通过分析得到柚皮苷占黄酮质量分数为64.27%。盛雪飞等[28]水浴提取胡柚得到黄酮含量为385.61 mg/g，柚皮苷含量为220.87 mg/g，所得柚皮苷占黄酮的57.27%。赵红英等[29]采用超声法提取不同栽培品种化州柚的黄酮含量为19.42%，柚皮苷质量分数为11.72%，提取的柚皮苷含量占黄酮含量的60.35%。相比之下，本实验从琯溪蜜柚皮中提取的柚皮苷含量占黄酮的比例高于其他研究的结果。

3 结论

本实验运用超声辅助提取法提取柚皮总黄酮及柚皮苷，优化的提取工艺条件为：液料比(mL∶g)为45∶1 ，超声时间为50 min，乙醇体积分数为70%，重复提取4次，黄酮提取量为70.69 mg/g，提取得到的黄酮中柚皮苷质量分数达到64.27%。