ABCG1基因启动子区甲基化与急性脑梗死的相关分析

张广炜，刘 丹

脑梗死是中老年人常见病、多发病，是全球中老年人长期残疾的首要原因。尽管诊疗技术不断进步，但大部分患者仍遗留有不同程度的后遗症，针对脑梗死进行积极有效的预防治疗，可降低脑梗死的发生[1,2]。ABCG1是ABCG家族的跨膜半转运蛋白，可在多个组织中高表达，同时也可参与脂质代谢过程，在巨噬细胞胆固醇的逆转运中间过程中，ABCG1可以防止过多的脂质聚集，减少动脉粥样硬化(AS)的形成，可起到保护血管避免动脉粥样硬化损伤的作用。

DNA甲基化是指S-腺苷甲硫氨酸上的甲基在DNA甲基转移酶的催化作用下,与胞嘧啶的C5位结合形成甲基胞嘧啶的化学修饰过程[3]。有研究提示，ABCG1的启动子区甲基化后，抑制了ABCG1的血管保护作用，使得AS的形成增加，同时也加重了动脉粥样硬化相关的心脑血管疾病的发生。据此，本课题主要研究ABCG1基因启动子区甲基化与急性脑梗死之间的相关性，为脑梗死的基因诊治提供一定的理论支持。

1 对象与方法

1.1 研究对象 病例组为随机筛选2017年7月-2018 年11月我院神经内科就诊的急性脑梗死患者，均为汉族 ,彼此无亲缘关系，共计84例;对照组为2017年7月-2018 年11月我院诊治的非脑梗死患者，共计90例。

病例组入选标准：(1)年龄≥18 岁；(2)发病时间≤7 d；(3)脑梗死诊断符合1996年全国第四届脑血管病学术会议修订的动脉粥样硬化性脑梗死的诊断标准，且经部CT或MRI检查证实。 排除标准：(1)既往曾有脑出血病史或CT显示存在脑出血；(2)有明显的心、肝、肾功能不全及恶性肿瘤；(3)存在心房颤动等严重心律失常；(4)心源性栓塞所致的卒中、腔隙性脑梗死及无症状性脑梗死。

1.2 方法与分组 病例组与对照组于入院次日清晨采集肘静脉血共计2 ml，用抗凝管留置并编号，置-20 ℃低温冰箱保存。进行亚硫酸氢盐修饰基因组DNA和基因组DNA纯化回收，甲基化特异性PCR(Methylation-specific polymerase chain reaction，MSP)检测和琼脂糖凝胶电泳判定甲基化结果，同时行血常规、生化等常规实验室检查，以及颈部血管彩超、CT、MRI等相关检查。

2 结 果

2.1 病例组和对照组的一般资料和临床实验指标对比 经独立样本t检验或χ2检验，结果显示年龄、性别、空腹血糖、TC、TG、LDL-C的组间P>0.05,差异无统计学意义；而收缩压、舒张压、抽烟史、饮酒史、HDL-C的组间P<0.05,差异有统计学意义(见表1)。

2.2 ABCG1基因甲基化特异性PCR检测结果 采用甲基化和非甲基化特异性引物扩增被亚硫酸氢盐修饰转化后的对照组和病例组DNA时，ABCG1甲基化引物与非甲基化引物扩增得到预期大小的扩增片段。在检测的病例组样本中，ABCG1因子启动子区有66人显示甲基化阳性，甲基化阳性率为78.6%；对照组中有43人显示甲基化阳性，甲基化阳性率为47.78%,P<0.01差异有统计学意义。

2.3 病例组与对照组一般资料、临床实验指标、ABCG1基因启动子区甲基化的相关性分析 分别对病例组与对照组和年龄、性别、抽烟、饮酒、血压、血脂及ABCG1基因甲基化情况进行Pearson线性相关或Spearman秩相关分析，结果显示：急性脑梗死与抽烟(r=0.349,P<0.01)、饮酒(r=0.162,P=0.033)、收缩压(r=0.259,P=0.001)、ABCG1基因启动子甲基化阳性情况(r=0.318，P<0.01)均为正相关，而与HDL-C(r=-0.255,P=0.001)为负相关，表明抽烟、饮酒、高血压、ABCG1基因启动子区甲基化均为急性脑梗死发病的危险因素，HDL-C为保护因素。而年龄、性别、空腹血糖、TG、TC、LDL-C、病例组和对照组未见明显相关(见表2)。

2.4 急性脑梗死发病危险因素的Logistic回归分析 以急性脑梗死的发生情况为因变量，以抽烟、饮酒、收缩压、HDL-C、ABCG1基因启动子区甲基化与ACI发病相关的指标为自变量，采用二元Logistic回归分析的进入法进行分析，在校正其他危险因素后，结果显示：抽烟史、收缩压、HDL-C、ABCG1基因启动子区甲基化有统计学意义(P<0.05)。并且从上述指标的OR值可以看出收缩压、抽烟史、ABCG1基因启动子区甲基化是ACI发病的独立危险因素，这些指标每升高一个单位，ACI发病风险分别为原来的1.028倍、3.449倍、3.047倍(收缩压:OR=1.028,95%CI1.009～1.046,P<0.01;抽烟史OR=3.449,95%CI1.631～7.293,P<0.01；ABCG1:OR=3.047,95%CI1.439～6.454,P<0.01)，而HDL-C是急性脑梗死发病的保护性因素，该指标每升高一个单位，发病风险为原来的0.211倍(HDL-C:OR=0.211,95%CI0.067～0.665,P<0.01)(见表3)。

表1 病例组和对照组的一般资料与临床实验指标对比

病例组与对照组比较*P<0.05,**P<0.01

表2 病例组与对照组临床检验和实验指标的相关分析

病例组与对照组比较r为相关系数*P<0.05，**P<0.01

表3 急性脑梗死发病危险因素的Logistic 回归分析

3 讨 论

本研究选取急性脑梗死患者84例(病例组)与同期来我科就诊的非脑梗死患者90例(对照组)，检测病例组与对照组外周血中的ABCG1基因启动子区甲基化的表达情况，同时探讨其与脑梗死的相关性。结果显示：一般资料对比显示，病例组相较对照组，血压、吸烟史、空腹血糖以及HDL-C之间，存在统计学差异。病例组的ABCG1启动子区甲基化阳性率为78.6%;对照组甲基化阳性率为47.8%，前者明显升高。脑梗死与吸烟、血压、空腹血糖、ABCG1基因启动子甲基化阳性均呈正相关，而与HDL-C呈负相关。并且Logistic回归分析发现：抽烟史、收缩压、ABCG1基因启动子区甲基化阳性是脑梗死发病的独立危险因素，HDL-C为脑梗死发病的独立保护因素。其中ABCG1基因启动子区甲基化每增加一倍，急性脑梗死发病率可增加2.959倍(OR=3.047;95%CI1.439～6.454;P=0.004)。

高血压、糖尿病、血脂异常、吸烟等是脑梗死发病的常见危险因素[4～10]，其中，由于动脉粥样硬化(AS)所导致的大动脉粥样硬化性脑梗死是脑梗死中常见且重要的一种类型，而血脂代谢异常是动脉粥样硬化发生发展中的重要环节：当各种理化因素使血管内皮受损后，血液中的低密度脂蛋白可以渗入血管内皮下，并且在血管内膜酶类的作用下发生氧化，进而导致血管内皮细胞黏附分子的激活，从而调节单核细胞进入血管内皮下，分化成巨噬细胞[11]，吞噬修饰后的脂蛋白颗粒，最终形成充满脂肪颗粒的泡沫细胞，导致了动脉粥样硬化的形成[12]。控制血脂异常有助于预防脑梗死的发生，因此对于如何调控血脂代谢异常仍是脑梗死防治的研究要点。

目前，对于血脂异常的调控，大量的研究集中在基因水平，其中有报道显示ABCG1参与了血脂代谢的过程，可能对血脂异常起到调控作用。ABCG1基因启动子区的甲基化与高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesferol，HDL-C)呈负相关，ABCG1能够促进细胞内的胆固醇流出，并与HDL-2、HDL-3、成熟HDL-C和其他富含脂质的载脂蛋白结合，在去除多余胆固醇的过程中起着重要的作用。ABCG1通过增加细胞内、外层之间胆固醇的运动来增强巨噬细胞的趋化性，最终使 HDL-C的作用加强从而促进AS的逆转，所以可以通过改变DNA甲基化的状态调节脂代谢紊乱，从而减缓 AS形成。

三磷酸腺苷结合盒(ATP-binding cassette,ABC)转运体是一类保守的跨膜蛋白,通过与ATP的结合、介导胆固醇从外周组织巨噬细胞中的流出。三磷酸腺苷结合盒转运体 G1(ATP-binding cassette G1，ABCG1)是ABCG家族的跨膜半转运体[13,14]，ABCG1在巨噬细胞中高表达,介导胞内胆固醇(尤其是氧化固醇)向HDL转运,维持细胞内外脂质的平衡[15]，最终使 HDL的作用加强从而促进AS的逆转，减缓AS形成。

DNA甲基化(DNA methylation)是在DNA甲基化转移酶的作用下，不改变DNA序列的情况下，对生物体的基因组功能进行调控，DNA甲基化是一种常见的表观遗传修饰，CpG 二核苷酸序列中的碳-5位置被甲基修饰,影响基因的表达，抑制调控基因的活性[16,17]。因此，ABCG1可能通过甲基化修饰来调节特异性基因的表达，引起动脉粥样硬化，从而导致脑梗死的发生。本研究采用的DNA甲基化检测方法为MSP法，相较于基因测序，该方法简便、经济，适合大样本检测。

已有动物研究表明，缺乏ABCG1的小鼠可出现胆固醇在巨噬细胞和肝细胞大量积累[18]。ABCG1在巨噬细胞中呈高表达，并在巨噬细胞的胆固醇逆转运过程中起关键作用。12/15-LOX基因启动子区甲基化可调控大鼠的AS的形成[19]，而在AS的发生发展中，TFPI-2基因的甲基化修饰，可能导致斑块的快速进展，同时增加了斑块的不稳定性，进而可导致脑梗死的发生，维持胆固醇水平的平衡对于AS的发生发展都起到至关重要的作用[20,21]。

有证据显示，ABCG1的表达可降低HDL和甘油三酯水平，而ABCG1启动子区甲基化可能通过增加甘油三酯水平，进而导致与血管阻塞相关疾病的发生[22],另外，肥胖及糖尿病均为脑梗死的危险因素，而ABCG1启动子区甲基化与糖尿病发病呈正相关[23,24]。

在本研究中还发现抽烟史是ACI发病的独立危险因素(OR3.449;95%CI1.631～7.293;P=0.001)，有可能是因为烟草中的尼古丁、一氧化碳及焦油会使内皮细胞受损，引起内皮功能紊乱，进而加速AS的形成，从而引起急性脑梗死的发生。

综上所述，在急性脑梗死患者中ABCG1基因启动子区存在DNA甲基化，且与急性脑梗死的发生有关。提示ABCG1基因可以引起脂质代谢紊乱，同时还有可能成为急性脑梗死的发病的独立危险因素，为急性脑梗死的基因治疗和预防提供了新思路。

本实验的不足之处：在已知疾病中，如糖代谢异常、舒张压的异常，均为脑梗死发病的危险因素[25,26]，本课题未得出此结论，可能与患者通过药物控制血压、血糖等情况有关，亦或是样本量少有关，并且血压为非连续性检测所得，仅为入院时两次血压结果的均值，因此，有可能会影响研究的结果，在今后的研究中，可以通过扩大样本量，完善研究方法，进一步证明。