液质联用技术的应用与发展

徐晓雅,陈 鑫,邓惠婷,张中琪

（武警安徽省总队医院，安徽 合肥 230061）

现代物理分析方法非常灵敏,以至于即使是很小的样本,它们也能提供精确而详细的信息。由于这些原因,它们现在被用于产品开发,制造和配方控制,存储期间的稳定性检查以及药品和药物的使用监控。定量分析中使用了各种方法,可大致分为化学/经典方法(滴定法,体积法和重量法）、仪器方法(分光光度法,极谱法,HPLC,GC）。液相色谱-质谱(LC-MS或HPLC-MS）是一种分析技术,它结合了液相色谱(或HPLC）的物理分离能力和质谱分析的质量分析能力。LC-MS是一种用于许多应用的强大技术,具有非常高的灵敏度和选择性。它通常用于药物的药代动力学研究,并且是生物分析领域中最常用的技术[1-2]。

1 LC-MS的基本原理

目前的液相色谱法通常使用非常小的颗粒填充并在相对高的压力下操作,并称为高效液相色谱(HPLC）,基本原理是吸附。质谱(MS）是一种测量带电粒子的质荷比的分析技术。它用于确定颗粒质量,确定样品或分子的元素组成,以及用于阐明分子(如肽和其他化合物）的化学结构。MS通过电离化学化合物来产生带电分子或分子碎片并测量它们的质荷比。在典型的MS程序中,将样品加载到MS仪器上并进行蒸发。通过各种方法(例如:通过用电子束撞击它们）使样品的组分电离,这导致带电粒子(离子）的形成。离子在分析仪中通过电磁场根据它们的质荷比分离。通常通过定量方法检测离子,离子信号被处理成质谱。此外,MS仪器由三个模块组成。离子源,可以将气相样品分子转化为离子(或者,在电喷雾电离的情况下,将溶液中存在的离子移动到气相中）。质量分析仪,通过施加电磁场对质量进行分类。检测器,测量指示剂量的值,从而提供用于计算存在的每种离子的数据。该技术具有定性和定量用途。这些包括识别未知化合物,确定分子中元素的同位素组成,以及通过观察其碎片来确定化合物的结构。MS现在在分析实验室中非常普遍,用于研究各种化合物的物理、化学或生物学性质[3]。

HPLC仅仅能分离物质,几乎不提供有关化学物质的额外信息。事实上,如果它只含有一种化学物质,HPLC很难确定特定峰的纯度。在此添加质谱可以告诉您峰中存在的所有化学物质的质量,可用于识别它们,以及纯度的检查。即使是简单的质谱也可以用作质量特异性检测器,特定于所研究的化学品。与其他色谱方法相比,LC-MS具有很多优点:(1）选择性:洗脱峰可通过质量选择性分离,不受色谱分离度的限制。(2）分子量信息:确认和鉴定已知和未知化合物。(3）结构信息:受控碎裂可以对化学品进行结构解析。(4）快速方法开发:无需保留时间验证即可轻松识别洗脱的分析物。(5）样品基质适应性:减少样品制备时间,从而节省时间。(6）定量:通过有限的仪器优化,可以轻松获得定量和定性数据[4]。

2 LC-MS的各种应用

2.1 分子生药学

LCMS确定不同组培养植物细胞的含量和类别,并选择成分含量差异最大的一组去研究成分差异表型克隆[5]。

2.2 化合物的表征和鉴定

2.2.1 类胡萝卜素

由于类胡萝卜素不具有热稳定性,混合物的分离和杂质的去除通常通过反相HPLC代替气相色谱法进行,可以采用质谱和串联质谱的数据来确认类胡萝卜素鉴定。迄今为止,已有五种LC/MS技术用于类胡萝卜素分析,包括移动带,粒子束,连续流快速原子轰击,电喷雾和大气压化学电离(APCI）[6]。

2.2.2 蛋白质组学

液相色谱/质谱(LC/MS）已成为药物发现中蛋白质组学研究的一项强有力的技术,其中包括靶蛋白表征和生物标记物的发现。基于MS的糖蛋白质组学研究用于表征检查中的糖肽串联MS片段化和数据分析问题提供了完整糖肽的有效表征,然后通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS）进行肽的分析。例如,马心肌肌红蛋白模型样品的蛋白质分析和肽质量作图通过LC/MS使用四极质谱仪完成[7]。

2.3 定量和定性分析

2.3.1 生物样品的定量分析

LC-MS/MS方法包括样品制备,组分分离和MS/MS检测以及若干领域的应用,如生物胺的定量,免疫抑制剂的药代动力学和兴奋剂控制。先进的技术包括LC-MS/MS仪器的自动化、色谱柱切换以及固相萃取的更高效使用,从而推动样品净化时间和总运行时间减少的趋势。与传统色谱技术相比,新引入的技术,如小颗粒(亚2 μm）的超高效液相色谱和单片色谱,可提高速度、分离度和灵敏度[8]。

2.3.2 复合脂质混合物的定性和定量分析

这是一种基于LC-MS的脂质混合物研究方法,已证明了其在分析人类脂蛋白相关脂质中的应用。在二氧化硅60上进行任选的初始分馏后,YMC PVA-Sil柱上的正相HPLC-MS首先用于分级,然后使用Atlantis dC18毛细管柱进行反相LC-MS或LC-串联质谱分析,以完全表征各个脂质。这里应用的方法用于分析人载脂蛋白B相关脂质。这种方法可以测定每种分子种类的脂质含量,并且从正常个体分离的载脂蛋白B-100-LDL相关的脂质与含有载脂蛋白B-67的载脂蛋白相关的脂质能显示出明显的差异[9]。

2.3.3 植物成分/植物代谢组学

LC-MS提供了一种区分这种巨大植物生物多样性的工具,因为该技术能够分析多种代谢物,包括次生代谢物(如生物碱,甙类,苯丙酸类,类黄酮,异戊二烯,芥子油苷,萜类,苯甲酸类）和高级分子(低聚糖和脂质）。LC-MS是确定全局代谢物谱的主要非靶向分析技术之一,有助于鉴定和相对定量色谱图中的所有峰,如最初由保留时间和分子量定义的离子。通过非靶向LCMS技术分析了榄仁果实的活性提取物[10-12]。

2.4 治疗药物监测中的自动免疫分析

某些具有较窄治疗指数的药物的治疗药物监测(TDM）有助于改善患者预后。对药物进行准确、精确和标准化的测量这一需求对临床实验室和诊断行业来说是个重大挑战。如今,基于液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS）的方法和免疫测定方法似乎是临床实验室中最广泛使用的方法。基于质谱具有分析敏感性和特异性,并能够在单个过程中测量多种化合物。这是一种监测接受多种药物治疗的患者(例如,结核病患者的抗菌治疗）的经济、有效的方法[13]。

2.5 临床化学和毒理学

对于某些临床化学和毒理学分析物,液相色谱(LC）与串联质谱(MS/MS）配对提供了优于免疫测定的传统测试的优势。测试的分析物包括雌二醇、睾酮、甲状腺激素、免疫抑制剂、维生素D、用于新生儿筛查程序的类固醇,以及临床和法医毒理学。虽然免疫测定通常用于临床实验室,但对于在常规临床实验室中测试的许多分析物而言,分析灵敏度和特异性较差。此外,LC-MS/MS可以多路复用,以实现高测试吞吐量和多种分析物检测。LC-MS/MS在临床化学和毒理学研究中的应用将得到改进,其优势众所周知。对于治疗药物的免疫测定很少,如果使用不当会导致毒性。无目标分析的目的是确定尽可能多的具有临床或法医重要性的药物,无论是否有免疫测定。尿液通常是首选的样本,但血清和血液也是少数重要的样本类型[14]。

2.6 二维（2-D）连字技术

LC-MS的使用已经成为一种强大的二维(2D）联用技术,可用于分析蛋白质、氨基酸、核酸、碳水化合物、脂类、多肽以及基因组学、脂质组学、代谢组学、蛋白质组学等领域。LCMS的组合是最优选的,能够强化各种分析和生物分析技术。LC-MS技术可以以敏感和特殊的方式精确地区分复杂的混合物,这种混合类型的HPLC和MS组合可以进行复杂混合物的常规定性发现和定量定向分析,这可能是最重要的组合之一。开发和分离,质谱在过去十年中通过检测各种分析和生物分析技术在科学领域发挥着重要作用。与LC系统相比,它提高了LC系统的稳健性和准确性,并在与MS系统结合时提高了检测能力[15]。

3 LC-MS的未来前景

3.1 代谢组学

目前,基于质谱(MS）的代谢组学,MS已广泛用于获得有关人类,植物,药物和生物标记物发现、营养研究、食品控制和微生物生物化学。

未来5到10年将不可避免地见证实验室之间合作的增加,以便于更快、更多的获得基于LC-MS的代谢物数据以及整理。对于具有类似模型样本和仪器的感兴趣的合作者,内部MS/MS库可能会更容易获得,从而增加了所有参与实验室人员的知识基础。通过对收集的LC馏分进行离线分析或通过混合LCNMR-MS仪器分析,NMR与基于LC-MS的代谢谱分析和代谢组学研究的整合可能会增加。相比之下,GC-MS不太可能成为LC-MS策略的集成组件,因为这两种技术存在根本差异,并且难以将这些补充信息用于未知生物标志物表征。然而,由于相对较差的电离效率,GC-MS仍将是量化那些不适用于LC-MS分析的代谢物的工具。可能会出现新的信息学工具,用于结合自动生成候选经验公式和立体异构体以生成检测到的代谢物特征,以及用于基于CID MS/MS碎片光谱预测未知代谢物化学结构的算法。

基于MS的代谢组学更为积极的是,光谱数据库的数量和质量在过去5年中显着增加。然而,这种增长会产生其他需要尽快解决的问题,以便在代谢组学方面取得更加明显的进展。两个主要问题是显而易见的,未来可以通过协调和统一的行动来最好地解决这些问题。问题一是,在化合物中心数据库中仅报告了5%～10%的已知代谢物。应通过将有机化学和代谢组学相结合的国际计划,以及可能涉及学术界和商业公司,解决来自真实化学标准的MS、MS/MS和MSn谱的增加。问题二是,尽管从毫无针对性的代谢组学研究中发现自然界中存在未知的代谢产物(即先前未发现）,但是由于加合物/片段阐明和化学/背景噪声的错误,这种现象是否会失真尚不明确。代谢组学数据库的较新前沿可以部分解决这个问题,代谢谱数据库的特征是具有良好的质谱结构,其中包含参考物质的所有加合物和碎片种类。此外,保存来自真实化学标准品的全扫描(MS1）光谱数据和显示加合物形成的差异,使其能够估计处理基于LC/MS的非靶向代谢组学的方法。光谱数据库有两种相反的趋势。首先,除了人类能力之外,越来越多的估计MS方法仍被用于提高参考精确质谱的质量。这包括信号处理和通过过滤来去除共同分离的峰,自动说明公式到片段峰以及光谱的重新校准甚至片段结构的注释。除了增强信息之外,所有这些步骤都可以作为光谱的附加质量控制,包括检测[16-17]。

3.2 蛋白质组学

在过去的十年中,用于肽段LC-MS仪器的惊人发展几乎使蛋白质样品制备(包括提取和消化）成为了蛋白质组学实验中一个重要的关键点。与非蛋白质污染物相关的样品清洁度会极大地影响蛋白质鉴定率。当前简化样品制备步骤和处理少量生物材料的趋势已使蛋白质提取、消化和分离整合在单个移液器吸头中,该吸头装有一小片嵌入分离材料的膜,即所谓的StageTip。考虑到蛋白质缺乏和植物细胞中化合物的干扰,将这些方案推广到植物材料中具有挑战性,但这是一个令人兴奋的挑战,因为研究SM的好处远超过开发工作[18]。

3.3 药物警戒

药物警戒(PV或PhV）,被称为药物安全性。它是涉及药物产品的不良副作用的收集、检测、评估、监测和预防的药理学之一。检测和监测可以通过基于LC-MS的疾病修改技术完成,该技术能提供详细的概况[19]。