液体静置发酵生产茯苓多糖条件的研究

2020-03-07何彩文蒋咏梅章文贤

生物化工 2020年1期

何彩文，蒋咏梅，章文贤

（工业微生物教育部工程研究中心，福建师范大学生命科学学院，福建福州 350117）

茯苓是一种寄生在松树根部的真菌，具有菌核、菌丝体和子实体3种形态特征。茯苓多糖是真菌茯苓中具有多种药理作用的主要活性成分，含量高达93%以上，主要存在于茯苓的细胞壁中。茯苓多糖中有水溶性多糖和碱溶性多糖两种类型，其中多数为碱溶性多糖。大量研究表明，茯苓多糖可治疗腹泻、呕吐、水肿、惊悸等症状，具有抗病毒、抗肿瘤、抗氧化以及免疫调节等生理活性，以及降血糖、镇静催眠、和胃益脾、退黄疸、消结石、增强机体免疫力、延缓衰老和改善学习记忆等药理作用[1-4]，在临床医学、食品药膳以及美容保健等领域具有广泛应用[5]。

茯苓生产有固体栽培和液体发酵两种途径，野生茯苓和传统栽培的人工种植茯苓均属于固体培养。随着现代发酵技术的发展，目前越来越多的方法采用液体深层发酵生产茯苓，对茯苓菌丝的生长条件和产物合成条件进行优化[6-9]。培养基的组成和环境条件，以及种子液的菌龄和接种量都会影响发酵结果。本研究采用一种液体摇瓶培养结合静置培养的方法生产茯苓多糖，找出对茯苓菌的生长和对茯苓多糖合成效果均最好的液体培养时间和静置培养时间，初步为采用这一方法生产茯苓多糖提供工艺条件。

1 材料与方法

1.1 菌种

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）培养7 d的斜面茯苓菌丝由福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心保藏并提供。

1.2 培养基制备

（1）斜面培养基：马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，MgSO40.5 g，KH2PO41.0 g，琼脂粉 16 g。

（2）种子培养基（1 L）：葡萄糖 35 g，蛋白胨 5 g，酵母粉 2.5 g，KH2PO41.0 g，MgSO40.5 g，pH 为 6.0。

（3）发酵培养基（1 L）：葡萄糖 35 g，蛋白胨 5 g，酵母粉 5 g，KH2PO41.0 g，MgSO40.5 g，pH 为 6.0.

1.3 实验方法

1.3.1 茯苓胞内多糖（IPS）的提取及测定

称取茯苓干细胞粉末100 mg，加入1 mol/L氢氧化钠于60 ℃水解1 h后，用水稀释一定倍数，用浓硫酸-苯酚法测定胞内多糖含量[9]。

1.3.2 发酵条件优化方法

种子液制备：用无菌水10 mL，水洗28 ℃条件下培养6 d的斜面一支，接入装有40 mL种子培养基的250 mL 摇瓶中，摇床（28 ℃，160 r/min）发酵，培养72 h，即为种子液。

发酵培养：500 mL摇瓶装发酵培养基200 mL，接种量按 10% 接种，摇床（28 ℃，160 r/min）发酵，培养相应天数。

摇瓶培养时间设定 2 d、3 d、4 d 和 5 d；静置培养时间 4 d、6 d、8 d、10 d、12 d 和 14 d。

2 结果与讨论

2.1 静置前液体发酵时间对茯苓菌丝细胞生长的影响

考察不同静置前培养时间对后续静置过程产生的影响。图1结果表明，静置前培养时间越长，越不利于茯苓菌丝的获得，在第4 d和第8 d测定菌丝干重，均是培养2 d时细胞量最大，但在第4～8 d的生长过程中，静置前培养时间越长，细胞的生长速率越大，前培养 2 d 和 5 d 的生长速率分别是 0.85 g/(L·d)和 1.13 g/(L·d)。

图1 静置前液体发酵时间对细胞生长的影响

2.2 静置前液体发酵时间对胞内多糖含量和产量的影响

静置前液体发酵时间对茯苓菌丝胞内多糖的积累影响较大。从图2可见，经过3 d前培养的菌丝，茯苓菌丝胞内多糖含量最高，在静置培养4 d和8 d后，胞内多糖含量分别高达 6.3 g/100 g 和 9.3 g/100 g CDW（CDW为细胞干重）。结合细胞量，如图3所示，计算胞内多糖的产量同样是在前培养3 d时最高，在静置8 d时，胞内多糖产量达到1.14 g/L。后续试验中采用前培养3 d的条件。

图2 静置前液体发酵时间对胞内多糖含量的影响

图3 静置前液体发酵时间对胞内多糖产量的影响

2.3 静置时间对细胞生长的影响

在液体培养3 d后开始静置培养，考察静置培养时间对茯苓菌丝生长的影响。图4结果表明，随着静置培养天数的增加，茯苓菌丝细胞干重迅速增长，超过5 d时细胞干重的增长趋势逐渐平缓，当静置培养天数约为12 d时细胞干重达到最大值，为 13.5 g/L。

图4 静置发酵时间对细胞生长的影响

2.4 静置时间对胞内多糖含量和产量的影响

图5结果表明，随着天数增加，茯苓菌丝胞内多糖含量逐渐增多且增加趋势逐渐平缓，在静置培养时间为 10 d时胞内多糖含量达到最大值，为 9.8 g/100 g CDW，之后胞内多糖含量下降。因此，静置培养10 d是茯苓菌丝胞内多糖含量的最佳时间。从胞内多糖产量来看，如图6所示，随着培养时间延长，胞内多糖产量不断上升，在第10 d时达到最大值，为1.28 g/L。