蔓三七叶多糖的柱层析纯化及理化性质研究

2020-03-07李华勇胡居吾

生物化工 2020年1期

李华勇，胡居吾

（1.江西省吉安市食品药品检验检测中心，江西吉安 343000；2.江西省科学院应用化学研究所，江西南昌 330096）

蔓三七，又名平卧菊三七，为多年生草本药食两用植物。蔓三七茎叶营养丰富，富含粗多糖和绿原酸等成分，多利用其消炎止咳、通经活络、消肿止痛，可用于治疗肺结核、支气管肺炎等[1]。现代生物化学和医学研究证明，蔓三七具有消炎止咳，散淤消肿等功效[2]，还具有提高人体免疫力、改善机体免疫功能的作用[3]，降血糖、降血压和抑制乙型肝炎的显著效果[4]。蔓三七又和木耳菜同属，食味柔滑，清香可口，具有极好的营养价值；可清炒、凉拌、氽汤，其叶也可生吃，或取鲜叶开水冲泡当茶饮，具有较高的经济价值。其中含有的多糖具有复杂的化学结构及丰富的生物活性，包括抗肿瘤[5]、抗炎[6]、抑制血管生成[7]、抗感染[8]、改善免疫功能[9]、调节血糖血脂[10]、保肝[11]等多种功效。

植物多糖经提取后，提取液中常含有蛋白质、色素、单糖、无机盐和各种小分子杂质，需要对粗多糖进行分离纯化。由于色素、小分子杂质在原料预处理（石油醚脱脂、乙醇浸泡）和醇沉过程中几乎被除去，因此除蛋白是多糖纯化过程中的重要环节，常用除蛋白的主要方法为Sevage法、木瓜蛋白酶法、三氯乙酸法等[12-13]。为了获得纯多糖组分，还需通过色谱柱法或分级沉淀法对除蛋白多糖进一步分离。

本研究采用三氯乙酸法对蔓三七叶粗多糖进行除蛋白，并利用DEAE-52纤维素柱和Sephadex G-75葡聚糖凝柱对除去蛋白的蔓三七叶多糖分离纯化，同时对纯化后的蔓三七叶多糖的理化性质进行测定。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蔓三七叶，购买自江西华紫仁农业开发有限公司，烘干、粉碎后过20目筛备用。

三氯乙酸、考马斯亮蓝G-250、碘化钾、牛血清蛋白、氯化钠，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司生产；纤维素填料 DEAE-52、葡聚糖凝胶G-75均为索莱宝生物科技有限公司生产。

1.2 仪器与设备

DZF-6090Z型真空干燥箱，上海跃进医疗器械有限公司；UV-1800 紫外可见分光光度计，日本岛津仪器有限公司；METTLER-TOLEDOAL104型电子天平，瑞士梅特勒-托利多公司；FD-1C-50冷冻干燥机，上海豫明仪器有限公司；层析柱（3 cm×30 cm），上海沪西分析仪器厂；CTO-20A柱温箱、RLO-10Z示差折光检测器，日本岛津公司。

1.3 试验方法

1.3.1 蔓三七叶粗多糖的提取

取烘干、粉碎后的蔓三七叶，按料液比1∶15加入蒸馏水，于65 ℃恒温水浴2.5 h，离心、抽滤，滤渣部分继续用同样方法浸提，上清液合并浓缩后缓慢加入4倍体积的无水乙醇沉淀粗多糖，于4 ℃低温静置24 h，再以 4 800 r/min 离心 10 min，收集下层粗多糖沉淀，最后用无水乙醇洗涤2次，沉淀物用65 ℃超纯水溶解、备用[14]。

1.3.2 蔓三七叶粗多糖中蛋白的去除

1.3.2.1 蛋白去除

采用三氯乙酸法除去蔓三七叶粗多糖中的蛋白质。将1.3.1下提取的蔓三七叶粗多糖溶解于蒸馏水并置于冰浴中，缓慢加入15%的三氯乙酸，不断搅拌直至溶液的pH为2～3，4 ℃下保持1 h，以达到蛋白质与多糖分离的效果。将溶液取出，离心15 min，收集上清液，浓缩，冷冻干燥得蔓三七叶除蛋白多糖样品[15]。

1.3.2.2 除蛋白多糖中蛋白质含量的测定

参照考马斯亮蓝法并稍作修改。配置0.1 mg/mL的牛血清蛋白溶液，分别称取 0.0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL至7个试管中，依次加蒸馏水补充到1 mL，再分别加入5 mL考马斯亮蓝试剂，立即摇匀，静置10 min。以第1只试管中的溶液作参比，测定595 nm处的吸光度，绘制牛血清蛋白溶液和吸光度的标准曲线。

将多糖样品配置成一定浓度，取1 mL按照上述操作测定样品中蛋白质含量。根据公式1和公式2计算蛋白质去除率和多糖保留率。

1.3.3 蔓三七叶多糖的DEAE-52纤维素柱层析

1.3.3.1 DEAE-52纤维素的预处理及装柱

将干燥的DEAE-52纤维素用蒸馏水浸泡24 h，使其充分溶胀，并不断搅拌以除去泡沫和杂质。将溶胀好的DEAE-52纤维素放置于0.5 mol/L的NaOH溶液中浸泡30 min，反复用蒸馏水洗至中性；再将碱处理后的DEAE-52纤维素置于0.5 mol/L的HCl溶液中浸泡30 min，用蒸馏水洗至中性，最后再置于0.5 mol/L的NaOH溶液浸泡30 min，蒸馏水洗至中性备用[12]。将预处理好的DEAE-52纤维素用适量蒸馏水溶解，搅拌均匀，缓慢地倒入层析柱（3.0 cm×30 cm），尽量避免装柱过程产生气泡，必要时可进行加压装填。为了使柱料稳定，需用蒸馏水平衡过夜。

1.3.3.2 多糖的DEAE-52纤维素柱层析

准确称取200 mg去除蛋白的蔓三七叶多糖样品，用极少量的蒸馏水溶解。将溶解的蔓三七叶多糖样品用胶头滴管沿着层析柱壁缓慢加入，待样品进入柱层析稳定后，依次用蒸馏水和NaCl溶液（0.05 moL/L、0.10 moL/L、0.20 moL/L）以 1 mL/min的流速进行洗脱。每管收集5 mL，并通过苯酚-硫酸法对每管中多糖的含量进行监测，绘制洗脱管数和吸光度值的洗脱曲线。根据洗脱曲线的峰形，分别收集洗脱液。然后对洗脱液进行浓缩、冷冻干燥，获得初步分离的蔓三七叶多糖组分，进行下一步SephadexG-75葡聚糖凝胶柱层析分离研究[15]。

1.3.4 蔓三七叶多糖的Sephadex G-75葡聚糖凝胶柱层析

1.3.4.1 Sephadex G-75葡聚糖凝胶的预处理及装柱

将干燥的Sephadex G-75葡聚糖凝胶粉末用蒸馏水煮沸3 h，使其充分溶胀。采用湿法装柱，将预处理好的葡聚糖凝胶用适量蒸馏水溶解并搅拌均匀，缓慢地倒入层析柱（3.0 cm×50 cm），避免柱内产生气泡和流干水分。装好的层析柱用蒸馏水平衡过夜。

1.3.4.2 蔓三七叶多糖的Sephadex G-75葡聚糖凝胶柱层析

将通过DEAE-52纤维素柱收集到的蔓三七叶多糖组分溶解于蒸馏水，并利用胶头滴管沿柱壁缓慢加入，待样品溶液稳定后，用蒸馏水以0.5 mL/min的流速进行洗脱。每管收集2 mL，共收集60管。再次用苯酚-硫酸法进行检测，绘制洗脱曲线。收集蔓三七叶多糖含量较高的组分，浓缩、冷冻干燥获得蔓三七叶纯多糖组分[15]。

1.3.5 蔓三七叶纯多糖理化性质的测定

1.3.5.1 物理状态检测

对蔓三七叶纯多糖的颜色、形态以及溶解性进行观察。

1.3.5.2 化学检测

考马斯亮蓝试验：参照1.3.2.2蛋白质含量的测定方法，将蔓三七叶纯多糖组分用蒸馏水溶解，加入5 mL考马斯亮蓝，混合均匀后观察其颜色变化。

苯酚-硫酸试验：参照胡居吾等[14]测定多糖含量的方法，将蔓三七叶纯多糖组分用蒸馏水溶解，加入1 mL苯酚，再缓慢加入浓硫酸，混合后观察颜色变化，并测定其多糖含量。

碘化钾试验：将蔓三七叶纯多糖组分用蒸馏水溶解，加入几滴碘-碘化钾溶液，观察其颜色变化，判断是否为淀粉类多糖[16]。

2 结果与分析

2.1 粗多糖中蛋白质去除率的测定

2.1.1 蛋白质标准曲线

以牛血清蛋白标准溶液的浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，制作标准曲线，结果如图1所示。回归方程y=7.794 5x+0.065 6（R2=0.999 7）。

图1 蛋白质标准曲线

2.1.2 粗多糖蛋白质去除率

蔓三七叶粗多糖被三氯乙酸除蛋白后，多糖中大部分蛋白质已被除去。经计算，蔓三七叶粗多糖中的蛋白质去除率为93.35%，蔓三七叶粗多糖保留率为84.27%。

2.2 DEAE-52纤维素柱纯化结果

从洗脱曲线（图2）可以看出，在本试验洗脱条件下得到4个洗脱峰，分别是以蒸馏水及0.05 mol/L、0.10 mol/L、0.20 mol/L 的 NaCl溶液洗脱得到。这是由于蔓三七叶多糖在以蒸馏水作洗脱溶液时，有些不带电多糖或者带有很弱的负电荷多糖不能被DEAE-52纤维素吸附或者吸附很弱，首先随着蒸馏水洗脱下来，即是图中的第1个洗脱峰。而多糖中带有负电荷的部分，被DEAE-52纤维素所吸附，必须用比DEAE-52纤维素吸附更强的Cl-、OH-来洗脱，才能将这部分蔓三七叶多糖洗脱下来。由图2洗脱曲线可以看出，在以不同浓度NaCl洗脱时均能得到或高或低的洗脱峰，考虑到节省时间和节约成本等因素，选取第1个峰位置与第4个峰位置进行收集，即分别以蒸馏水和0.2 mol/L的NaCl溶液作为洗脱液，洗脱下的多糖分别为蔓三七叶中性多糖（GPLP-D1）和蔓三七叶酸性多糖（GPLP-D2）。

图2 DEAE-52洗脱曲线

2.3 Sephadex G-75葡聚糖凝胶柱层析洗脱

蔓三七叶多糖组分中性多糖（GPLP-D1）和蔓三七叶酸性多糖（GPLP-D2）分别经过Sephadex G-75葡聚糖凝胶柱层析的洗脱结果如图3a和图3b所示。由图3a和图3b可知，蔓三七叶中性多糖（GPLP-D1）和蔓三七叶酸性多糖（GPLP-D2）经蒸馏水洗脱后均出现单一的吸收峰，分别收集两种洗脱液，浓缩、冷冻干燥后分别得到蔓三七叶中性纯多糖（GPLP-S1）和蔓三七叶酸性纯多糖（GPLP-S2）。

图3 Sephadex G-75 洗脱曲线

2.4 GPLP-S1和GPLP-S2理化性质的测定

GPLP-S1和GPLP-S2的理化性质如表1所示。GPLP-S1和GPLP-S2均为白色粉末，都易溶于水，不易溶于乙醇、丙酮等有机试剂。GPLP-S1、GPLP-S2与苯酚-硫酸反应后均显示出多糖成分，与考马斯亮蓝和碘化钾反应后颜色均无明显改变，表明两种多糖是非淀粉多糖且不含蛋白质，多糖纯度分别为91.65%和92.06%。