阿魏酸香兰素发酵条件的优化

2020-03-07邢晨光

生物化工 2020年1期

邢晨光

（厦门欧米克生物科技有限公司，福建厦门 361000）

香兰素（Vanillin），又名香草醛，学名4-羟基-3-甲氧基苯甲醛，在秘鲁香脂、丁子香芽油、香子兰、咖啡、葡萄和白兰地中有发现，具有香子兰气味，味甜[1-3]。香兰素是一种重要的香料，可以作为赋香剂、矫味剂、协调剂、增香剂应用于食品、烟草、日化和农业。因其用途广泛，每年的需求量以10%的速度增长，但国内产量仍然满足不了国内外市场需求[4-5]。

香兰素的生产方法有化学合成法、提取法、生物转化法和酶法[6]。随着人们健康意识的提高，天然香兰素的需求量和价格持续攀高，也成为了近几年研究的热点[7]。但是天然香兰素通过植物提取所得，数量有限，远远满足不了市场的需求，而化学合成法所造成的环境负担也越来越重，所以生物转化法和酶法成为生产香兰素的主力军[8-9]。

本文采用生物转化法，以阿魏酸为底物通过微生物代谢而生成香兰素，周期短、产率高、污染少，经过对发酵条件的优化，已具备工业化条件。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

沙链霉菌（Streptomyces psammoticus）OMK-4，保藏于厦门欧米克生物科技有限公司菌种室。

1.2 主要仪器

30 L自动补料发酵罐，上海保兴生物科技有限公司；高效液相色谱（HPLC），美国安捷伦，1260Ⅱ；生物传感器，山东科学院，SBA-40E；分光光度计，岛津，UV-1780；pH计，梅特勒，S-210S。

1.3 培养基

1.3.1 种子培养基

可溶性淀粉 1.0～3.5 g/L，磷酸二氢钾 0.1～0.5 g/L，尿素0.1～0.3 g/L，硫酸镁0.05～0.10 g/L，碳酸钙0.1～0.3 g/L，酵母浸粉 0.1～1.0 g/L，玉米浆 0.1～1.0 g/L，硫酸铵0.1～0.6 g/L，阿魏酸 0.2 g/L。

1.3.2 发酵培养基

可溶性淀粉 2.0～5.0 g/L、磷酸二氢钾 0.1～0.3 g/L、尿素 0.1～0.5 g/L、硫酸镁 0.05～0.1 g/L、碳酸钙 0.5～2.0 g/L、酵母浸粉 0.1～1.0 g/L、硫酸铵 0.1～0.5 g/L、阿魏酸 2.0 g/L。

1.4 培养方法

1.4.1 种子培养

在无菌条件下从培养好的固体斜面上用接种铲划一满环长势良好的菌株接入无菌种子培养基中，该种子培养基初始pH为5～8，在培养温度28～35 ℃、转速200～500 r/min的条件下培养菌体到对数生长期。

1.4.2 发酵罐培养

将培养至对数生长期的种子液在无菌条件下以5%～15%的体积比接入发酵培养基；发酵培养基初始 pH 为 7.2～7.8，在温度 30～40 ℃、搅拌转速 200～500 r/min，通气量 1 ∶ 0.5 的条件下发酵 70～120 h。

1.5 发酵条件优化

1.5.1 pH对香兰素发酵的影响

发酵过程的pH不仅影响到底物的存在形式，还和细胞的渗透压有关联，影响底物进出细胞，为得到最优发酵pH，考察不同的pH控制对香兰素效价的影响，具体方法为：（1）发酵整个过程的pH控制为7.5；（2）0～12 h控制pH为7.5，后续控制pH为8.0；（3）发酵整个过程pH控制为8.0。

1.5.2 溶氧对香兰素发酵的影响

实验证明，发酵液中溶氧的控制对菌体的生长以及后期产物的积累均有较大的影响，因此，需要对发酵过程中的溶氧进行控制。为得到最优的发酵溶氧控制，考察不同的溶氧控制对菌体和产物的积累影响。具体实验如下：通过转速和通气量联动分别将溶氧控制在0%、10%、20%、30%、40%和50%。

1.5.3 培养温度对香兰素发酵的影响

温度对微生物的生产、代谢产物的合成和积累都有重要的影响作用。温度升高会加快微生物的生长代谢，但是温度过高也会导致菌体提前进入衰亡期，影响产物的积累。因此对菌株进行温度优化具有重要的意义[10]。为得到最优的发酵培养温度，考察不同的培养温度对菌体生长的影响，通过控制温度分别为25 ℃、30 ℃、35 ℃和 40 ℃来对比菌体生长情况和香兰素的积累情况，从而获得最优的温度控制方式。

1.5.4 接种量对香兰素发酵的影响

不同的接种量对菌体正常的生长和代谢有重要的影响作用，接种量过小时会导致菌体生长缓慢，菌体生长的延滞期加长，次生代谢产物复杂不利于后期产物的积累；接种量过大会导致菌体过度生长，培养基营养物质损耗加大，溶氧量达不到控制要求[11]。因此控制发酵接种量具有重要的意义。为得到最优的发酵接种量，考察不同的接种量对菌体生长的影响，通过接种量分别为1%、3%、5%、7%和9% 5个梯度来对比菌体生长情况和香兰素的积累情况，从而获得最优的接种量。

1.6 分析方法

菌体浓度测定：取培养液用蒸馏水稀释一定倍数后混匀，在620nm波长下，利用分光光度计测定吸光度。

残糖测定：采用斐林试剂滴定法进行测定[12]。

香兰素含量测定：采用HPLC进行检测[13]。

2 结果与讨论

2.1 pH对香兰素发酵的影响

如图1所示，在pH为7.5时，菌体生长情况较好，最大OD620为0.62；pH为8.0时菌体生长情况较差，最大OD620为0.41；pH在0～12 h为7.5，后续控制为8.0，最大OD620为0.64。因此，pH为7.5时有助于菌体的生长，pH越高，菌体生长越缓慢。从分段控制pH可以看出，在后期pH调至8.0时菌体生长并没有受到影响，因此在发酵12 h左右菌体已经基本达到稳定期。

从图2可以看出不同的pH控制下，香兰素浓度分别为 13.200 g/L、16.988 g/L 和 14.500 g/L；在 0～12 h控制pH为7.5，后续控制pH为8.0时香兰素转化率最高，pH为8.0时转化率次之，pH为7.5时转化率较差，可能是因为在pH为8.0时酶活要优于pH为7.5时。

综合图1和图2可以总结出菌体在pH为7.5时菌体生长情况较好，在pH为8.0时酶活转化率较高，因此选择在发酵过程中进行分段控制有助于菌体的生长并获得较优的酶活。

图1 不同pH控制对菌体生长的影响

图2 不同pH控制对发酵生产香兰素的影响

2.2 溶氧对香兰素发酵的影响

从图3可以看出，随着溶氧量的不断增加，菌体浓度越来越大，其中在溶氧量为0%时，菌体生长情况最差，基本不长菌体；在溶氧量在40%～50%时，是菌体最适生长条件，菌体生长至最高，OD620为0.75左右。在溶氧量不断增加的情况下，菌体进入对数生长期的时间逐渐减小，在溶氧量达到40%～50%时，菌体生长的适应期最短，可以快速进入对数生长期，缩短发酵周期。因此，可以判断菌体生长需要大量的氧气供应，在溶氧量为40%～50%时菌体生长情况最佳。

从图4可以看出，随着溶氧量的不断增加，香兰素的积累量呈现先逐渐上升、再缓慢下降的趋势；在溶氧量为30%左右时，香兰素的积累量最佳，最高可以达到17.5 g/L左右；在溶氧量较低时，香兰素的积累量少可能是因为菌体生产情况不佳，酶量不够或者低溶氧情况影响了酶活力。随着溶氧量的逐渐增加，香兰素的积累量逐渐出现了下降趋势，特别是在50%溶氧量的情况下，在发酵后期会出现香兰素减少的情况，在检测过程中发现副产物香草酸的积累量逐渐增加，怀疑是溶氧量过大导致整个代谢流偏向产生香草酸。因此在产香兰素的阶段，溶氧控制不宜过高，避免影响其整体的转化率。

综合图3和图4可以看出，在发酵过程中对溶氧的控制选择分段控制，其中在菌体生长阶段溶氧控制在40%～50%，以保证菌体量的积累并缩短菌体生长周期；在发酵产香兰素阶段将溶氧控制在30%左右以保证产物的快速积累。

图3 不同溶氧量对菌体生长情况的影响

图4 不同溶氧量对香兰素转化量的影响

2.3 培养温度对香兰素发酵的影响

从图5可以看出，温度较低时菌体生长较为缓慢，随着培养温度的升高菌体浓度越来越高，在温度达到35 ℃左右时，菌体浓度最高，OD620达到0.73；然而，随着温度升高至40 ℃，菌体浓度开始降低，可能是因为温度过高破坏了菌体正常的代谢环境。

从图6可以看出，随着温度的逐渐升高，香兰素的转化率越来越高，转化效果按照大小依次排序为35 ℃、30 ℃、40 ℃和 25 ℃；按照每份菌体转化效率计算，最适温度依次为 40 ℃、35 ℃、30 ℃和25 ℃。从中可以看出，随着温度的逐渐升高，香兰素的转化率越来越高，在较高温度下，香兰素的转化率要优于低温环境下香兰素的转化。

对比图5和图6可以看出，温度对OMK-4菌株发酵转化香兰素的影响较大，综合两方面的对比，选择在温度为35 ℃下进行菌株的培养和香兰素的转化。

图5 不同温度对菌体生长的影响

图6 不同温度对香兰素转化的影响

2.4 接种量对香兰素发酵的影响

从图7可以看出不同接种量对最终菌体浓度的影响，5种不同的接种量最终均能达到菌浓0.7左右，其中1%的接种效果较差，最高菌浓仅为0.65左右。在前10 h，随着菌种量的加大，发酵的延滞期明显缩短，对比1%和9%的接种量，延滞期明显缩短了6 h左右。从图8可以看出9%的接种量明显要差于其他4种接种量，可能是由于在培养过程中菌体主要是在供给与菌体浓度的增加，酶活力相对会减小。因此接种过程中接种量不宜过大。对比1%、3%、5%和7%的接种量，5%的接种量条件下，香兰素转化率略高于其他4种，最高转化量依次为17.21 g/L、17.23 g/L、18.05 g/L 和 17.27 g/L。综合考虑图7 和图8，最终选择最优的接种量为5%。