阳山鸡出生后早期左卵巢组织结构发育的变化*

罗来福 郑淑欣 刘为民 赵海全 张 晖 叶亚琼

（佛山科学技术学院，生命科学与工程学院，佛山 528231）

大量文献报道，畜禽胚胎发育的早期已经有生殖腺的原基，称为生殖嵴，它的发育与胚胎期的临时泌尿器官—中肾密切相关。生殖腺原基在中肾内缘处形成，以后该处体腔上皮逐渐增厚变为圆柱形的生殖上皮，形成了隆起的生殖嵴，之后有原始生殖细胞主动迁移进入，然后经历髓质发育而演变为睾丸或者髓质发育后退化萎缩，再经历皮质发育而形成卵巢[1]。母鸡的生殖系统由卵巢和输卵管组成。在胚胎早期，左、右各有1 个卵巢和1 条输卵管，在发育的过程中右侧的退化，只有左侧的卵巢和输卵管发育成熟[2]。关于鸡胚胎期以及出生后卵巢的发育变化，已有丰富的文献报道，但针对广东特产的优良地方品种阳山鸡却缺乏实际观察资料，特别是雏鸡出生后1 周内卵巢的连续组织学观察。本实验通过对广东著名地方优良品种阳山鸡出生后卵巢组织结构的发育观察，为阳山鸡的繁殖、生产性能等研究提供科学的理论依据。

1 材料和方法

1.1 动物来源

从本校动物房饲养的阳山鸡经人工授精产得的85 枚受精蛋，并在本校的科研禽场进行孵化，最终孵化出65 羽小鸡。刚出生的小鸡及时进行性别辨别。雌雄分开常规饲养，各日龄雏鸡均生长发育良好。

1.2 解剖与取材

从孵出开始，隔天宰杀小鸡直至7 d 龄，即1、3、5 d 和7 d，平均每个时间组含4 只雏鸡。将出生后不超过24 h 的小鸡定为1 d 龄。通过颈静脉放血致死雏鸡，用剪刀将股内连接腹侧的皮肤剪开，将小鸡以背卧位平放于手术盘，暴露腹腔、胸腔，轻轻将整个腹腔内器官向前牵拉，直至完全暴露腹腔背侧部，卵巢由结缔组织系于腹顶壁下方，接近中线。用剪从卵巢的底部连带背部结缔组织以及部分肾和肾上腺一起剪取而使卵巢脱离腹腔，再用剪和刀片轻轻去掉多余的结缔组织，于PBS 中漂洗掉残余的血迹，取得的卵巢组织放入10%甲醛溶液固定。

1.3 制石蜡组织切片

组织块固定至少48 h 以上。于通风柜厨内修整组织块，放入脱水框内流水冲洗组织块3 h，经脱水、透明、石蜡包埋，切4～6 μm 厚的石蜡切片，62℃烤片6 h，H-E 染色，光学树脂封片。

1.4 组织切片观察

使用显微镜进行高、低倍对照观察，并把观察结果以照片形式拍下。

2 结果

2.1 解剖观察

雏鸡右侧卵巢大约于5 d 龄开始退化，而左侧卵巢继续发育成为功能性卵巢。卵巢形状为扁椭圆形，分为两叶，颜色为灰白色。

2.2 卵巢的组织结构

刚出生的小鸡卵巢主要分为皮质、外髓质和内髓质，呈扁片状覆盖在肾和肾上腺表面（图1）。皮质与髓质被结缔组织分隔开，此结缔组织隔膜即为初级白膜。皮质层和髓质层分界明显。

皮质位于髓质的浅面，因其染色浅且细胞质略呈弱嗜碱性，极易与髓质区分。出生1 d 龄时，皮质主要由10 余层多边形球状生殖细胞构成，细胞体积较大。在皮质层的浅面，即卵巢的表面有1～2层小而呈柱状或梭状的生殖上皮细胞被覆（图2）。整个皮质从横切面观呈厚薄均匀的带状，生殖上皮延伸向下，成为小叶间小梁，不完全地分隔皮质带为长方形小叶（图1），小叶间小梁向深面抵达髓质；每个小叶里包含许多大而圆的生殖细胞，胞液清亮，胞核大而且染色深，核膜不明显，染色质呈粗纤维状或组成网状，未见核仁（图2、3）。

髓质较厚，细胞排列密集，细胞小而染色深，常可见在髓质内有上皮细胞索，称为髓质索，索细胞也称间质细胞。它们较皮质的生殖细胞小，成群围成腺叶状，但不形成腺腔，细胞核小而圆，居中，核膜清晰，细胞质丰富，淡染。髓质内还出现大量不规则的裂隙，状如血管断面，但仔细观察则无典型的内皮细胞，这便是腔隙道[3]。根据腔隙道的有无，髓质分为外髓质和内髓质，外髓质细胞排列密集并含有多种细胞，内髓质上皮细胞索较少，含有丰富的腔隙道、脉管和神经。在外髓质中，可以区分出索内间质细胞、间充质细胞、索外间质细胞。根据González-Morán[3]报道，观察到索外间质细胞体积稍大，核大而圆，核膜清晰，核仁清晰，异染色质呈小块状分布，常染色质丰富，细胞界限模糊。间充质细胞细胞界限模糊，核较小，形状不规则，核膜及核仁均模糊，异染色质少。腔隙道的结构与静脉明显不同，即围成腔隙道的扁平上皮细胞数量较多，形态类似于肾小管髓袢细段，但管腔大而不规则。

2.3 出生后1 周左侧卵巢的组织学变化

2.3.1 皮质的变化 从3 d龄开始，皮质细胞开始发生变性、空泡化等退行性变化，短期内细胞大量消失，到5 d龄时皮质在生殖上皮下方出现大片细胞间的空白区（图4），细胞排列松散，主要剩下一类多突起星形细胞，核模糊，胞质少而嗜酸性增强（图5）。空白区之间从髓质伸向表面的小隔愈显突出。至7 d龄时，外髓质已经出现了明显的卵泡，此时皮质几乎蜕落殆尽，仅存少量生殖上皮层（图6）。

2.3.2 外髓质的变化 随天龄增加，外髓质的细胞逐渐增多，约在5 d 龄时，外髓质初步出现卵泡（图4）。卵泡细胞显现，为单层柱状细胞，胞质嗜酸性增强，开始整齐排列为1 层，其内隐约可见卵母细胞，为不规则形，初在卵泡细胞之间，其后转移到卵泡中央，核膜核仁均模糊不清（图4）。在卵泡形成的同时，卵泡颗粒层外出现1～2 层长梭状细胞，为卵泡膜，核染色较深，而髓质索的外围则没有这种细胞。7 d 龄时，可见清晰明显的卵泡，卵母细胞快速变大，直径可达40 μm，核体积变大，核膜及核仁均清晰（图6）。随着皮质的退化，外髓质最终成为真正的皮质部。

值得注意的是在大量的生殖细胞消失的同时，皮质与髓质之间的界线显得极不整齐，似乎在界面上出现许多裂隙（图4）。

2.3.3 内髓质的变化 内髓质的腔隙道随日龄的增加而变得丰富。皮质与髓质之间的界线也越来越模糊，最终界线消失。初级白膜成为位于生殖上皮下的真正的白膜。

图1 1d龄雏鸡左侧卵巢，示皮质、外髓质、内髓质，标尺=100 μm，H-E 染色。C：皮质；OM：外皮质；IM：内皮质，LC：腔隙道.Fig 1 The left ovary from 1-day-old chick showing the cortex，out medulla and inner medulla，bar=100 μm，H-E staining.C：Cortex；OM：Out medulla；IM：Inner medulla；LC：Lacunar channel.

图2 3d龄皮质与髓质，标尺=20 μm；H-E 染色。C：皮质；OM：外皮质；↑示生殖上皮.Fig 2 The cortex and medulla of the left ovary from 3-day-old chick，bar=20 μm，H-E staining.C：Cortex；OM：Out medulla；↑ indicated the germinal epithelium.

图3 3d龄皮质，额切（水平切），标尺=20μm；H-E 染色.Fig 3 The cortex from 3-day-old chick，frontal section，bar=20 μm，H-E staining.

图4 5d龄左侧卵巢，正处于崩解的皮质，标尺=20 μm，H-E 染色。C：皮质；OM：外皮质；F：正在生成的卵泡，其与髓质索的区别在于细胞团外围有2 层长梭状细胞包围，↑示1 个异嗜性粒细胞.Fig 4 The left ovary from 5-day-old chick showing the degenering cortex，bar=20 μm，H-E staining.C：Cortex；OM：Out medulla；F：Newborn follicles showing the two layers of narrowed fusiform cells around the follicles，wich were the difference between the follicle and the primary sex cord.↑showed a heterophil leucocytes.

图5 崩解处皮质高倍观，细胞形态不规则，胞质嗜酸性增强，许多细胞仅剩核和周边少量胞质；细胞间出现大片空白，标尺=10 μm，H-E染色.Fig 5 Higher magnification of the degenering cortex composed of loose arranged，irregular and enhanced acidophile cells，many of them consisted of nuclei and thin plasma around the nuclei，bar=10 μm，H-E staining.

图6 7d龄左侧卵巢，外髓质出现一层生长卵泡（↑），皮质几乎消失殆尽，标尺=20 μm，H-E 染色。C：皮质；OM：外髓质；D：原皮质小叶间隔，与髓质相连。此时卵母细胞直径大约40 μm，核清晰可辨，核仁明显，核膜不明显.Fig 6 The left ovary from 7-day-old chick showing a layer of growing follicles in the out medulla，noting that the primary cortex had losed nearly at all.The diameter of the oocytes in the follicles were about 40 μm，they had clear nuclei，obvious nucleoli and some obscure karyotheca，bar=20 μm，H-E staining.C：Cortex；OM：Out medulla；D：The diaghragm between primary cortex lobes，which merged into the out medulla.

3 讨论

前人研究表明[4]，母鸡只有左侧卵巢是正常发挥功能的。母鸡出生后的右侧卵巢逐渐萎缩变小；或者母鸡一生中的右侧卵巢以1个不起眼的遗迹存在，只有很少的母鸡的右侧卵巢会以1个完整的和有功能的卵巢存在。当人工地以外科手术摘除左侧卵巢后，右侧卵巢可以发育为有功能的卵巢，所以许多研究者推测左侧卵巢对右侧卵巢有抑制作用[5-7]。

禽类卵巢的被膜由生殖上皮和白膜组成。生殖上皮是由单层上皮细胞构成，通常上皮细胞是立方形的，核为泡状圆核。生殖上皮下是1 层白膜，由较致密的结缔组织构成。本实验观察到，阳山鸡在出生后的5 d 龄皮质层发生退化崩解，位于皮质下的初级白膜逐渐暴露，形成了卵巢真正的白膜。原有的生殖上皮层去向如何，是散落消失还是沉积在初级白膜表面，由于本实验是隔天取材观察，对此疑问尚难给出确切答案，需要进一步实验观察。

关于皮质的发育变化，本观察在1～3 d 龄时，可见明显的皮质层，其内充满了大而饱满的生殖细胞，它们的核在1～3 d 龄发生了急剧的变化，在1 d 龄时，核膜完整，核仁清晰，胞质清亮，及至3 d 龄时，核膜消失，核质呈粗纤维状伸展，核仁不显，整个核呈染色质凝缩散开的状态，全层生殖细胞变化相当同步，但不同区域之间的生殖细胞则可处于不同的减数分裂阶段。到5 d 龄时这些细胞几乎全部消失不见，仅剩下大量的空隙和散在网状排列的未知类型的细胞。后者有进一步聚集成层，进而形成或加强初级白膜的作用。上述观察与González-Morán（2011）[3]在1 d 龄白来亨鸡观察结果相同，该作者在1 d 龄雏鸡也观察到完整饱满的皮质层。按照该作者的观点，雏鸡卵巢的生殖细胞既分布于皮质，也分布于髓质，它们属于卵原细胞或卵母细胞，在皮质成群分布。González-Morán 认为皮质的生殖细胞可能通过向髓质移行而参与卵泡的形成，但在本研究中仅仅在卵巢的内外两端很小的区域观察到了分布于髓质的泡状的卵母细胞，其他大部区域的髓质根本看不到这类胞质丰富的卵母细胞，因此笔者尚不能同意González-Morán 关于皮质卵母细胞向髓质移动的观点。此外，本实验在皮质可见的卵母细胞均呈现出整齐同步的形态特点，均处于卵母细胞的细线-粗线期，如此大量的细胞如果全部转化为卵泡的卵母细胞，则整个卵巢的卵泡数量将十分惊人，因此必定有相当数量的卵母细胞将发生闭锁。关于卵母细胞的闭锁问题，Greenfield[8]通过电镜观察到鸡卵母细胞在生后的发育过程中很少发生闭锁，这与本实验观察到的卵母细胞在3～5d 龄大量消失的结果不相符。卵巢的生殖细胞是由来源于胚胎孵化第2～3 天的卵黄囊壁的原始生殖细胞演化而来[9]。早在20 世纪30年代，一些作者就发现，给予遗传上是雄性的鸡胚在6 胚龄之前注射一剂微量的雌激素可以诱导出左侧性腺卵巢化，即生出明显的皮质，这种皮质在孵化后第3 天开始发生崩解，然后该性腺发育形成睾丸[10]。这说明在性分化的关键时期（孵化的5～7 d），左侧性腺生殖上皮表达雌激素受体以及性腺髓质分泌雌激素是性腺性别分化的关键事件。因此笔者推测，左侧原皮质从形成到退化大约经历16～21 d 的存续时间，然后完成其历史使命而退化。那么这种“历史使命”是什么？很少有文献关注。本实验在5～7d 龄观察到卵泡的形成是在非常接近皮质的髓质内形成的，此时的皮质几乎消失殆尽，则皮质在卵泡形成过程中没有起到实质性的作用，其真正的作用仍然是一个迷。

关于前卵泡细胞，本实验也存在着同样的疑问。前卵泡细胞是指形成卵泡颗粒层的前体细胞，处于皮质内，González[3]在白来亨鸡卵巢能清楚地观察到这类细胞，但本研究则未能观察到这类细胞，直到其在卵泡形成时才可区分出来，它们是从皮质移入的还是就在髓质内存在的？尚不明确。综上所述，本实验由于仅在1、3、5、7 d 间隔观察，观察结果是初步的，许多细节仍待进一步观察考证。