孕期微波辐射暴露对新生鼠前额叶皮质微细和超微结构的影响*

李 容 刘良财 王凌星

（1 泉州医学高等专科学校，泉州 362000；2 福建省晋江市公安局，晋江 362200；3 福建医科大学附属第二医院，泉州 362000）

随着电磁波技术的高速发展并广泛应用于通讯、医疗、军事和交通等诸多领域，人类生活的环境充斥着越来越多且越来越复杂的电磁辐射，特别是移动电话的迅猛普及，加之使用者对其的依赖性与日俱增，不可避免地会让使用者接受手机电磁辐射的剂量大大增加，尤其是胚胎发育敏感的孕期受到手机辐射对仔代潜在的健康隐患令人堪忧。现今最广泛使用的民用手机，其工作时的中心频率（900 MHz）属于微波范畴。目前报道的动物实验研究和流行病学调查结果均显示中枢神经系统是电磁辐射损伤最敏感的系统之一[1]，前额叶位于大脑额叶的最前部，前额叶皮质是指除初级运动皮层和次级运动皮层以外的全部额叶皮层，其功能与疼痛[2]、认知[3]和睡眠觉醒[4]等密切相关。现有的国内、外学者对孕期手机辐射暴露对仔代新生鼠中枢神经系统健康影响的研究结果尚有争议，故对其进行研究。

1 材料和方法

1.1 实验动物和主要试剂

45 只SPF 级 成年SD 大 鼠（雌∶雄=2∶1），上海斯莱克实验动物有限公司SCXK（沪）2012-0002。常规化学试剂由上海国药生物公司提供。

1.2 动物分组和处理

按传统方法参照文献进行交配[5]。15 只孕鼠随机分为3 组，每组5 只：空白对照组（常规饲养，不辐射）、低强度辐射组（21 d 全身辐射，6 h/d）和高强度辐射组（21 d 全身辐射，12 h/d）。辐射时手机持续置于笼顶处于通话状态，中心工作频率为90 MHz。称孕第1 天和20 天孕鼠（临产前）和出生后24 h 内的新生鼠体质量。每窝随机留取3 只（即每组15 只）新生鼠，随机取5 只在乙醚麻醉下进行灌注后取前额叶皮质甲醛溶液固定待H-E 染色观察微细结构，余10 只断颈处死取前额叶皮质置电镜保存液中备电镜观察超微结构。

1.3 H-E 染色观察微细结构

固定脱水后的新生鼠前额叶皮质，石蜡包埋；切片，置于60 ℃烘箱中烤1～2 h；常规二甲苯、乙醇脱蜡至水；苏木精染色8 min（37 ℃）；流水冲洗30 s 去余色；0.7%盐酸乙醇分化5 s，流水冲洗、变蓝约10 min；7.90%乙醇25 s；伊红染 25 s；双蒸水冲洗10 s，75%乙醇15 s →85%乙醇15 s →95%乙醇20 s →100%乙醇20 s，石碳酸二甲苯20 s →二甲苯20 s；封片，倒置镜下拍照观察。

1.4 电镜制样观察超微结构

按要求在倒置显微镜下取新生鼠前额叶皮质 1 mm×1 mm×1 mm 组织小块；3%戊二醛-1.5%多聚甲醛-0.1mol/L PBS（pH7.2）4 ℃前固定数天（2 h 以上）；0.1 mol/L PBS（pH7.2）漂洗3 次；1%锇酸-1.5%亚铁氰化钾4 ℃后固定2 h；0.1 mol/L PBS（pH7.2）漂洗3 次；乙醇-丙酮脱水；浸透，无水丙酮+环氧树脂618 包埋剂包埋；修块，半薄切片，定位；UC-6 型Leica 超薄切片机切成超薄的100 nm切片，经醋酸铀和柠檬酸铅分别染色8～ 15 min后，蒸馏水水洗；在EM208型Philips透射电镜下观察摄片。应用多功能彩色图像分析系统对突触间隙、突触后致密物厚度以及致密物长度定量检测。

1.5 统计学处理

采用SPSS 20.0 软件进行统计分析，数据以±s来表示，主要采用t检验和方差分析。

2 结果

2.1 孕鼠及新生鼠体质量情况

2 个辐射暴露组和空白对照组孕鼠在孕期外观及饮食活动情况无明显异常。2 个辐射暴露组和空白对照组的母鼠在孕第1 天和孕第20 天体质量（表1），同期在各组间差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 微波辐射暴露期孕鼠体重变化（n=5，±s，g）Tab1 Changes in body weight of pregnant rats exposed to microwave radiation（n=5，±s，g）

表1 微波辐射暴露期孕鼠体重变化（n=5，±s，g）Tab1 Changes in body weight of pregnant rats exposed to microwave radiation（n=5，±s，g）

Group 1 d 20 d Blank control group 289.84±17.29 399.87±16.79 Low intensity radiation group 301.26±16.33 415.72±19.92 High intensity radiation group 295.49±20.68 402.33±24.55

新生鼠全部自然分娩，未发现死产。空白对照组、低强度辐射组、高强度辐射组出生后24 h内的体质量依次为（8.34±0.26）、（8.29±0.17）、（8.40±0.25）g，各组间差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 新生鼠前额叶皮质微细结构

空白对照组（图1A）为正常脑前额叶皮质微细结构，细胞有序整齐、层次分明。辐射暴露组（图1B、C）主要表现为神经元皱缩、变性、坏死、脱落、排列紊乱，呈三角形或不规则形，核固缩、深染，血管淤血，血管周间隙增宽。

2.3 新生鼠前额叶皮质超微结构

2.3.1 神经细胞 空白对照组（图2A1）细胞形态良好，胞膜光滑连续，胞核规则，细胞器结构和数量正常。低强度辐射组（图2B1）细胞整体形态尚好，胞膜粗糙，胞质内次级溶酶体空泡化（a1）。高强度辐射组（图2C1）细胞形态不规则，胞质均匀化，细胞器大部分流失，粗面内质网增生扩张呈囊性改变、脱颗粒（b1），线粒体空泡样变（c1）。

2.3.2 髓鞘 空白对照组（图2A2）髓鞘螺旋包绕轴索，板层排列致密、均匀连续（a2）。低强度辐射组（图2B2）髓鞘板层松解、染色变浅（b2），有髓纤维变形。高强度辐射组（图2C2）髓鞘扭曲变形、部分断裂（c2），胞质内细胞器溶解模糊。

2.3.3 定量检测 对突触间隙、突触后致密物厚度及致密物长度定量检测结果见表2。

图1 新生鼠前额叶皮质H-E 染色，bar=50 μmFig 1 H-E staining of the prefrontal cortex of newborn rats，bar=50 μm

图2 新生鼠前额叶皮质电镜图片，bar=2 μm Fig 2 Electron microscope images of the prefrontal cortex of newborn rats，bar=2 μm

表2 孕期微波辐射暴露新生鼠前额叶皮质神经元突触超微结构定量分析（n=10，±s，nm）Tab 2 Quantitative analysis of ultrastructure of neuron synapse in the prefrontal cortex of newborn rats exposed to microwave radiation during pregnancy（n=10，±s，nm）

表2 孕期微波辐射暴露新生鼠前额叶皮质神经元突触超微结构定量分析（n=10，±s，nm）Tab 2 Quantitative analysis of ultrastructure of neuron synapse in the prefrontal cortex of newborn rats exposed to microwave radiation during pregnancy（n=10，±s，nm）

*P＜0.05 vs blank control group；△P＜0.05 vs low-intensity radiation group

Group Synaptic cleft Density thickness Density length Blank control group 19.9±1.22 16.98±1.85 379.16±20.11 Low-intensity radiation group 27.49±3.51* 35.43±3.62* 481.35±19.43*High-intensity radiation group 31.92±1.93*△ 51.52±1.94*△ 533.24±17.38*△

3 讨论

微波是一种频率范围在300 MHz～300 GHz的电磁波，而目前被广泛使用的数字手机在通话状态时的中心频率为900 MHz，属于微波范畴。国内、外学者围绕电磁辐射对机体的实验研究和流行病学调查报道的结果不尽相同，如Guilbaud 等[6]通过实验得出孕早期（孕1～3月）电磁辐射暴露不会增加子代流产、发育迟缓、畸形甚至死胎的风险。但大部分研究者认为孕期电磁辐射暴露会导致仔代健康受到损害，如Li、Yilmaz、Lu、Haghani 和Razavinasab 等[7-11]通过实验分别得出孕期微波辐射暴露会使仔代发生肥胖的几率增高、造成永久性的肝毒性、增加出生时低体重儿的风险、对蒲肯野神经细胞的电生理性能产生不利影响和能改变子鼠脑CA1 区神经细胞固有的生理特性；Aldad 等[12]对小鼠宫内微波辐射模型进行研究，结果仔鼠活动过度、前额叶皮质中谷氨酸能突触功能受损，通过全细胞膜片钳记录的突触后电流显示神经元的发育程序发生改变，提示产前使用手机和儿童发生注意缺陷多动障碍之间可能有相关性，且有研究表明临床常用于治疗多动障碍的药物派醋甲酯可改变前额叶皮质中突触的可塑性，推测孕期微波辐射暴露可能导致前额叶皮质神经元和突触形态结构发生改变。

前期研究[13]为预期能得出结果提示了实验设计方向，故动物实验模型设计了1 个极限高强度（21 d，24 h/d）辐射组。但实际中孕妇不可能整个孕期每天24 h 持续使用手机，因此基于前期实验结果的基础，本实验设计了1 个低强度辐射组（21 d，6 h/d）和高强度辐射组（21 d，12 h/d），这样更符合实际。

本实验结果显示：孕鼠和新生鼠体质量各组间未见显著差异，并未出现流产、宫内发育迟缓、死胎和畸形等，说明孕期微波辐射暴露在宏观上并未表现出异常，这一结果与Guilbaud 等[6]的报道一致，但这一结论并不表明器官的微细和超微结构不发生改变。观察新生鼠前额叶皮质的微细结构，2个辐射暴露组的神经元出现排列紊乱、脱落和坏死等，说明孕期微波辐射暴露导致新生鼠前额叶皮质神经元微细结构改变；从对新生鼠前额叶皮质的超微结构看，2 个辐射组的突触间隙、突触后致密物厚度和宽度，与空白对照组相比显著增宽、增厚和增长；高强度辐射组的突触间隙、突触后致密物厚度和宽度，与低强度辐射组相相比显著增宽、增厚和增长，神经细胞和髓鞘也随着辐射强度的增加，出现了形态结构的损伤。

不足与展望：（1）实验动物造模还有待改进，本实验是对孕鼠全身辐射，而实际中孕妇使用手机多靠近头部，故以后可期造模时将手机固定在孕鼠头部；（2）本实验结果得出新生仔鼠前额叶皮质微细和超微结构的改变，但其具体机制尚不清楚，以期进一步探讨研究；（3）器官功能是由形态结构决定的，形态结构的损伤，势必会导致功能的改变，今后的实验研究可增加对神经系统相应功能的活体检测；（4）此研究结果为评估孕期微波辐射暴露风险提供初步依据和参考。