金柑CDDP-PCR反应体系优化研究

陈燕丽，唐志鹏，欧克纬，卢业飞，张 宇，3，*

(1.广西大学 农学院，广西 南宁 530004； 2.广西壮族自治区亚热带作物研究所，广西 南宁 530001； 3.广西土壤肥料工作站，广西 南宁 530007)

金柑(Fortunellajaponica)属芸香科(Rutaceae)金柑属(FortunellaSwingle)，是原产于中国南方经济果树[1-2]。随着国内经济实力的提升，金柑种质资源的收集、保护和利用等工作取得了积极的研究成果。但由于金柑多芽变，传统分子标记技术不能全面而准确地反映金柑遗传规律的变化。CDDP(conserved DNA-derived polymorphism)分子标记于2009年被开发出来，其原理是针对基因家族或功能基因中保守碱基序列设计单引物，用琼脂糖凝胶电泳分离，差异性条带多，重复性好。与传统分子标记相比，CDDP分子标记目标性更强，且具有易操作、低费用、普遍性等优势，采用CDDP分子标记进行种质鉴定、亲缘关系研究以及后续的分子植物育种具有深远的意义[3-4]。目前，基于CDDP分子标记研究的植物供试材料有：微齿菝葜[5]、耐冬山茶[6]、芒果[7]、越橘[8]、牡丹[9]、大豆[10]、甜菜[11]、菊花[12]、铁皮石斛[13]和水稻[3]等，但尚未见基于CDDP分子标记研究金柑的报道。本研究以金柑作为研究对象，构建优化CDDP反应体系，筛选PCR引物，以期为后续品种鉴定以及分子辅助育种等研究工作提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为桂金柑一号、桂金柑二号、脆密金柑、滑皮金柑、融安金柑，采集时间为2018年10月3日，采集部位为健康成熟叶片。样品处理参考张宇等[14]的方法。CDDP引物为已公布的21条通用引物[7]。

1.2 方法

1.2.1 金柑叶片DNA提取与检测

参考张宇等[14]的方法。提取金柑叶片DNA后进行琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖质量浓度为0.9%；在NanoDrop 2000超微量紫外光检测仪上进行浓度和质量检测[15]。

1.2.2 金柑CDDP-PCR反应体系L16(45)正交优化设计

参考张宇等[14]的方法，用L16(45)正交试验设计方法对dNTPs浓度、引物浓度、模板DNA用量、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶用量设计4水平5因素试验(表1)，共计处理16份，每个处理重复3次，各处理总体系均为20 μL。dNTPs、引物、Mg2+、TaqDNA聚合酶均购自凯杰生物技术(上海)有限公司。利用直观分析法对每个处理结果进行评分，评分为16个等级，评分标准为条带清晰度、明亮度、丰富性、特异性，最高最低分分别为16分和1分，打分为整数分[15]。评定结果用SPSS 10.0软件分析。

表1 金柑CDDP-PCR反应体系L16(45)Table 1 Fortunella japonica ISSR-PCR reaction system L16(45)

括号中数字代表水平。
Numbers in parentheses represented the level.

1.2.3 金柑CDDP-PCR引物筛选及扩增程序稳定性验证

PCR仪(S10001H96 Deep Well)购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性58 s，退火58 s，72 ℃延伸100 s，36个循环；72 ℃后延伸500 s，10 ℃保温。用已公布的21条CDDP通用型引物进行PCR筛选，取10 μL扩增产物，加入2.0 μL上样缓冲液，将质量浓度1.9%琼脂糖凝胶(含荧光核酸染料)放入电泳缓冲液中电泳。根据电泳结果筛选引物。

2 结果与分析

2.1 金柑CDDP反应体系的正交优化分析

以引物ERF1(5＇-CACTACCGCGGSCTSCG-3＇)为例，进行16个处理的CDDP-PCR扩增，其结果存在较大差异。其中处理8、9条带模糊；处理1、12、16条带数量少；其余处理均可扩增出满足后续试验要求的条带，其中处理5、6、7的扩增条带数目多且整洁。

金柑正交优化试验结果所示(图1)，5因素4水平的16个处理PCR凝胶电泳结果存在较大差异。评分结果可见表1。计算总和T、平均值X以及极差R，结果见表2。其中R是反映某一因素对该反应体系构建影响的强弱，R越大代表该因素对PCR结果影响越大，分析数据可知：dNTPs>引物>模板DNA>Mg2+>TaqDNA聚合酶，是该反应体系中5因素对PCR结果影响强弱的最终排序。

(1)、(2)、(3)、(4)对应表1中的处理水平。(1)， (2)， (3) and (4) correspond to the treatment level in Table 1.图1 金柑CDDP-PCR正交试验设计L16(45)电泳结果(引物ERF1)Fig.1 Electrophoresis analysis of CDDP-PCR L16(45) product for Fortunella japonica with primer ERF1

对正交试验的结果进行方差分析(表3)可以深化区分各个因素对金柑CDDP-PCR扩增影响的程度，对金柑CDDP-PCR扩增影响越大，F值越大，从大到小依次为：dNTPs>引物>模板DNA>Mg2+>TaqDNA聚合酶，与表2分析结果相同。表3结果能更全面地反映各因素间的差异显著性，dNTPs、引物和模板DNA的影响达到了极显著差异水平，Mg2+的影响达到了显著差异水平。

运用Duncan多重比较法分析5因素，确定每个因素在反应体系中的最佳浓度(表4)。0.20 mmol·L-1dNTPs均值最高与0.15 mmol·L-1dNTPs无显著差异，与0.10 mmol·L-1dNTPs、0.25 mmol·L-1dNTPs差异显著，遵循节省原材料的原则确定本反应体系中最佳dNTPs浓度为0.15 mmol·L-1；1.0 μmol·L-1引物均值最高且与其他引物浓度都有显著性差异，因此确定本反应体系中最佳引物浓度为1.0 μmol·L-1；120 ng DNA用量均值显著大于其他浓度，确定本反应体系中最佳DNA用量为120 ng；1.5 mmol·L-1Mg2+浓度均值最高，且与2.0 mmol·L-1Mg2+无显著性差异，不论从节省原材料角度还是从最高均值角度考量1.5 mmol·L-1Mg2+浓度都是本反应体系的最佳选择；TaqDNA聚合酶各浓度间无显著性差异，但0.75 U均值最高，姑且确定0.75 UTaqDNA聚合酶为本反应体系的最佳选择。

表2 金柑CDDP-PCR反应正交试验L16(44)结果均值Table 2 Result of orthogonal test for Fortunella japonica CDDP-PCR reaction

T1～T4，每一因素同一水平下的总和；X1～X4，为每一因素同一水平下的平均值；R，极差。
T1-T4， Sum of every factor under the same level;X1-X4， Mean of every factor under the same level;R， Range.

表3 金柑CDDP-PCR反应体系正交设计方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal design of Fortunella japonica CDDP-PCR

**表示0.01水平差异极显著；*表示0.05水平差异显著。
** showed the significant difference at 0.01 level;* showed the significant difference at 0.05 level.

表4 金柑CDDP-PCR各因素水平间Duncan多重比较Table 4 Multiple comparisons of Duncan between CDDP-PCR reactions

同一因素不同水平的数据后没有相同字母表示差异显著(P<0.05)。
The values in the same column of the same factor with different letters showed the significant difference(P<0.05).

将各因素各水平下3次重复评分数据进行整理(表1)，求每个因素和每个水平下评分的总和(表5)，为选择反应体系各因素最佳水平组合提供更丰富的借鉴。采用此法判断各因素最佳浓度用量快速直观，分数值是唯一判断标准，分数最高即为最佳选择。由此判断0.20 mmol·L-1dNTPs浓度、1.0 μmol·L-1引物浓度、120 ng模板DNA用量、1.5 mmol·L-1Mg2+浓度和0.75 UTaqDNA聚合酶浓度是该反应体系的最佳浓度用量组合。

2.2 CDDP-PCR反应体系稳定性验证及引物筛选

应用优化反应体系(表1)以及Collard和Mackill设计的21条CDDP引物进行PCR扩增。供试金柑品种均可扩增出共有性条带和特异性条带。PCR图谱既表现了金柑种内的稳定遗传性，又体现了品种间的遗传差异，表明该优化体系适用于金柑CDDP-PCR分析。利用5份金柑品种对目前已公布的所有CDDP引物进行筛选(图2)。观察可知，21条CDDP引物均适用于金柑CDDP-PCR扩增。

表5 各因素各水平评分情况Table 5 Scores of each factor and level

1、2、3 、4、5依次代表桂金柑一号、桂金柑二号、脆蜜金柑、滑皮金柑、融安金柑，每幅图的下方注明了该PCR结果所用引物名称。1， 2， 3， 4 and 5 represented Jingan No.1 Kumquat， Guijingan No.2 Kumquat， Cuimi Kumquat， Huapi Kumquat， Rongan Kumquat， respectively， and the primers used for the PCR results were indicated at the bottom of each figure.图2 二十一条CDDP引物对5个金柑品种的PCR扩增结果Fig.2 PCR amplification of 5 Fortunella japonica varieties with 21 CDDP primers

3 结论与讨论

为了确保基于CDDP分子标记行进种质鉴定、亲缘关系分析等研究结果的理想性，有必要对dNTPs浓度、引物浓度、模板DNA用量、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶浓度进行优化设计并且进行引物筛选[16-17]。本试验采用L16(45)正交试验设计方法同时结合直观分析法、PCR电泳产物扩增图观察、极差法、方差分析法、Duncan多重比较法和各因素各水平评分综合推论出适用于金柑CDDP-PCR反应体系构建各因素的最佳浓度用量组合[18-23]。

5因素4水平(表1、图1)构成的16份处理反应体系扩增结果差异巨大。其中处理1、8、9、12、16的PCR效果不够理想；其余处理均可扩增出满足后续试验要求的条带，处理5、6、7扩增效果较好，采用直观分析法打分结果也较高。各因素对反应体系的影响大小也是选择正交优化组合的重要评判标准。极差法(表3)以R值作为评判标准，R值越大该因素对反应体系影响越大，方差分析法(表4)以F值作为评判标准，判断标准同R值一样。极差法和方差分析法所得结果相同，可以确定各因素对金柑CDDP-PCR反应体系影响从大到小依次为：dNTPs>引物>模板DNA>Mg2+>TaqDNA聚合酶。

Duncan多重比较法和各因素各水平评分情况(表1、图1)可以得出反应体系各因素的最佳浓度用量。由Duncan多重比较法分析可知：0.20 mmol·L-1dNTPs、0.15 mmol·L-1dNTPs均值较高且与0.10 mmol·L-1dNTPs、0.25 mmol·L-1dNTPs存在显著性差异，遵循节省原材料的原则确定本反应体系中最佳dNTPs浓度为0.15 mmol·L-1；1.00 μmol·L-1引物均值最高且与其他引物浓度都有显著性差异，因此确定本反应体系中最佳引物浓度为1.00 μmol·L-1；120 ng 模板DNA用量均值显著大于其他浓度，确定本反应体系中最佳DNA用量为120 ng；1.5 mmol·L-1Mg2+浓度均值最高且与2.0 mmol·L-1Mg2+无显著性差异，不论从节省原材料角度还是从最高均值角度考量1.5 mmol·L-1Mg2+浓度都是本反应体系的最佳选择；TaqDNA聚合酶各浓度间无显著性差异，但0.75 U均值最高，姑且确定0.75 UTaqDNA聚合酶为本反应体系的最佳选择且该因素是本反应体系所有因素当中唯一不存在显著性差异的因素，也印证了该因素对反应体系影响效果最小。因此，由表1可以得出，反应体系最佳浓度用量组合应该是22434。由各因素各水平评分情况分析可知：求各因素各水平下打分的总和(表5)。分数值是唯一判断标准，分数最高即为最佳选择。由此判断0.20 mmol·L-1dNTPs浓度、1.0 μmol·L-1引物浓度、120 ng模板DNA用量、1.5 mmol·L-1Mg2+浓度和0.75 UTaqDNA 聚合酶浓度是该反应体系的最佳浓度用量组合，由表1可以得出，反应体系最佳浓度用量组合是23434。将目前已公布的21条CDDP引物全部应用于5个金柑品种的CDDP-PCR反应，其电泳结果(图2)显示21条CDDP引物均能扩增出条带清晰、层次分明、差异丰富的凝胶电泳结果，说明目前已知的21条CDDP引物全部适合于金柑的种质鉴定以及后续的分子研究工作。