猪链球菌2型制苗用菌株的筛选

陈 章，吴华健，毛天骄，韩业芹，孙 裴，魏建忠，李东风，李 郁，*

(1.安徽农业大学 动物科技学院，安徽 合肥 230036； 2.安徽省兽药饲料监察所，安徽 合肥 230001)

猪链球菌病是链球菌属中猪链球菌(Streptococcussuis，SS)、马链球菌类马亚种(Streptococcusequisubsp equi)、马链球菌兽疫亚种(Streptococcusequisubsp. Zooepidemicus)和兰氏(Lancefield)分群中D、E、L群链球菌引致猪疫病的总称[1]，临床症状主要表现为脑膜炎、心内膜炎、关节炎和急性出血性败血症[2]。SS是世界范围内引起猪链球菌病的最主要的病原，根据SS荚膜抗原的差异性可分为35个血清型(1/2型和1～34型)，其中以2型猪链球菌(SS2)对猪的致病力最强，流行范围最广[3]。临床上SS2常与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、支气管炎波氏杆菌和副猪嗜血杆菌混合感染或继发感染，导致猪群发病率和死亡率都明显上升[4-5]。

近些年来我国猪场猪链球菌病发病频繁，不仅给公共卫生安全带来威胁，同时也给养殖业造成了巨大的经济损失[6-7]。目前，防控猪链球菌病的主要措施是疫苗免疫接种和抗菌药物防治。然而，抗生素的乱用、滥用等不合理使用导致耐药菌不断产生，且多重耐药谱逐年增加，因此疫苗免疫接种成为防控猪链球菌病的有效办法[8]。由于SS血清型种类众多，各型SS致病力和生物学特性存在差异，且相互之间缺乏有效的交叉免疫保护力[9]，故在生产中常出现免疫失败或免疫不确实的情况。本研究从6株临床分离的SS2强毒株中，基于致病力、抗原性和稳定性试验，最终综合筛选确定SS2制苗用菌株，从而为研制具有更佳免疫保护性的灭活疫苗及其多联、多价疫苗提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验菌株

受试菌株是由安徽农业大学动物传染病实验室自临床病例分离鉴定的43株SS2，经毒力因子溶血素(suilysin，SLY)、溶菌酶释放蛋白(muraminidase released protein，MRP)、胞外蛋白因子(extracellular protein factor，EF)、荚膜多糖(capsular polysaccharide，CPS)检测，对昆明鼠、斑马鱼的致病力试验和溶血性(绵羊血、兔血)测定，初步筛选6株SS2强毒株，分别编号为BB1、BZ1、XC1、HF1、HF2、HF3[10]。

攻毒菌株源自临床急性败血型病猪，由安徽农业大学动物传染病实验室分离、鉴定和保存，对斑马鱼的LD50为0.62×102CFU·mL-1(SS2标准菌株ATCC43765对斑马鱼的LD50为3.14×104CFU·mL-1)，编号AH10-8并确定为攻毒菌株[10]。

1.2 主要试剂

三卡因购自济南嘉格生物科技有限公司；HRP标记的羊抗兔、羊抗鼠IgG抗体均购自Sigma公司；小牛血清购自南京宝灵科生物技术有限公司；0.6%酵母浸膏胰酪胨大豆肉汤(TSB-YE)、0.6%酵母浸膏胰酪胨大豆琼脂(TSA-YE)均购自绍兴天恒生物科技有限公司。

1.3 试验动物

试验用80日龄的AB系斑马鱼(体长约3.6 cm)购自合肥裕丰花鸟市场御龙水族馆，参考Rowe等[11]方法进行饲养；3～4月龄新西兰大白兔、SPF级雌性昆明鼠(体质量18～22 g)均购自安徽医科大学试验动物中心。

1.4 抗原和血清制备

1.4.1 SS2抗原

重组溶血素蛋白(SLY)由安徽农业大学动物传染病实验室提供，经免疫攻毒保护试验和Western blotting鉴定其具有良好的反应原性和免疫原性[12]，分子量为60 ku，-80 ℃保存备用。AH10-8株全菌体超声破碎裂解物制备：在100 mL TSB-YE中接种AH10-8攻毒菌株，150 r·min-137 ℃培养14 h，利用超声破碎充分释放菌体抗原[12]，-80 ℃保存备用。

1.4.2 血清

SS2阴性鼠(兔)血清：采集健康鼠(兔)未免疫接种SS2阴性血清，-20 ℃保存。SS2阳性鼠(兔)血清：在TSB-YE中接种SS2受试菌株，150 r·min-137 ℃培养14 h，以0.3%体积比加入甲醛灭活，与氢氧化铝胶均匀混合，对昆明鼠进行腹腔接种(每只0.5 mL)，对家兔进行肌肉接种(每只5 mL)，一免14 d后进行第二次免疫，2次免疫的途径及剂量均相同。二免后7 d，昆明鼠眼球静脉采血[13]，家兔心脏采血[14]，收集SS2阳性血清，-20 ℃保存备用。

1.5 致病力试验

用递加法测定6株受试菌株的最大非致死量(LD0)和绝对致死剂量(LD100)。在LD0和LD100区间范围内，设置5个剂量组，相邻组间剂量参考文献[13]，每株受试菌株设置5个组，采用寇氏改良法计算受试菌株的LD50。昆明鼠攻毒试验中，每组小鼠10只，试验组每只小鼠注射0.3 mL受试菌液，空白对照组小鼠注射等体积生理盐水，统计一周内小鼠死亡情况并对受试菌株进行回收鉴定。斑马鱼攻毒试验中，每组斑马鱼15尾，攻毒组每尾斑马鱼注射10 μL受试菌液，空白对照组斑马鱼注射等体积生理盐水，统计72 h内斑马鱼死亡情况并对受试菌株进行回收鉴定。数据采用q检验(95%置信水平)，计算各组q值，根据q界值表取舍极端值[9]。

1.6 灭活全菌体制备

在50 mL的TSB-YE中，按体积比1∶100将6株受试菌株进行转接并增菌14 h，以浓缩或稀释的方式使活菌数均达到2.0×109CFU·mL-1，按照0.3%的体积比加入甲醛灭活，之后利用无菌PBS对灭活菌体清洗4次。在TSB-YE中接种200 μL灭活菌液，180 r·min-137 ℃培养24 h，观察菌液是否浑浊，若菌液未变浑浊，于TSA-YE上涂布200 μL菌液，37 ℃培养18～24 h，观察TSA-YE上是否有细菌生长。若无细菌生长，按氢氧化铝胶∶菌液体积比1∶9将氢氧化铝胶加入灭活成功的菌液中，待搅拌均匀，置4 ℃保存。

1.7 抗原性试验

1.7.1 昆明鼠、新西兰大白兔血清IgG抗体检测

分别用包被液将AH10-8株全菌体超声裂解物和纯化的重组SLY稀释成10 μg·mL-1，包被酶标板4 ℃过夜，洗板3次后，50 g·L-1的脱脂奶粉37 ℃封闭2 h，再次洗板3次后，血清从1∶25稀释至1∶819 200，同时设置阴性对照和2个重复孔，37 ℃作用1 h。洗板3次后，分别加入稀释的羊抗鼠HRP-IgG(1∶3 000)和羊抗兔HRP-IgG(1∶50 000)，37 ℃作用1 h。洗板3次后加入TMB显色液，37 ℃避光静置10 min，加入H2SO4终止液，轻微震荡后置于全波长多功能酶标仪中测定D490。根据待测血清D490(P)/阴性血清D490(N)≥2.1的界限判定为阳性，并测定其抗体效价。

1.7.2 斑马鱼免疫攻毒试验

将120尾斑马鱼随机分成8组，每组15尾。试验组分别为BB1、BZ1、XC1、HF3、HF2、HF1灭活全菌体，每组每尾斑马鱼免疫10 μL灭活菌液(2×109CFU·mL-1)，空白对照组和攻毒对照组免疫等量PBS。一免14 d后进行加强免疫，免疫佐剂为氢氧化铝胶佐剂。二免7 d后，使用AH10-8株对试验组和攻毒对照组进行攻毒，攻毒剂量为50 LD50，空白对照组注射等量PBS，均采用腹腔注射方式攻毒。统计斑马鱼的死亡情况，并计算免疫保护率。

1.7.3 昆明鼠免疫攻毒试验

将40只昆明鼠随机分成8组，每组5只。试验组分别为BB1、BZ1、XC1、HF3、HF2、HF1灭活全菌体，每组每只昆明鼠免疫灭活菌液0.5 mL(2×109CFU·mL-1)，空白对照组和攻毒对照组免疫等量PBS。一免14 d后进行加强免疫，免疫途径均为腹部皮下多点注射，免疫佐剂均为氢氧化铝胶佐剂。二免7 d后，使用AH10-8株对试验组和攻毒对照组进行攻毒，攻毒剂量为50 LD50，空白对照组注射等量PBS，均采用腹腔注射方式攻毒。统计昆明鼠的死亡情况，并计算免疫保护率。

1.8 稳定性试验

在TSA-YE上接种所筛选受试菌株，37 ℃恒温培养出单个菌落后进行转种为1次传代，连续作30次传代。测定第10代、20代、30代受试菌株对斑马鱼和昆明鼠的LD50。制备所筛选受试菌株的第10代、20代、30代灭活全菌体，采集鼠抗SS2阳性血清和阴性血清完成ELISA抗体效价测定。利用所筛选受试菌株的第10代、20代、30代灭活全菌体，测定其对斑马鱼和昆明鼠的免疫保护率。

2 结果与分析

2.1 致病力试验结果

BB1、BZ1、XC1、HF1、HF2、HF3对斑马鱼和昆明鼠的LD50(表1)，其中受试菌株BZ1、HF2、HF3对斑马鱼和昆明鼠的LD50均低于HF1、XC1、BB1。

2.2 抗原性试验结果

2.2.1 昆明鼠和兔血清IgG抗体检测结果

如表2所示，以重组SLY作为包被抗原时，二免昆明鼠血清中BZ1的IgG抗体效价(1∶3 200)最高，二免兔血清中BZ1和HF3的IgG抗体效价(均为1∶6 400)最高。以AH10-8株全菌体超声裂解物作为包被抗原时，二免昆明鼠血清中BZ1和HF2的IgG抗体效价(均为1∶25 600)最高，二免兔血清中BB1和HF2的IgG抗体效价(均为1∶204 800)最高。

2.2.2 斑马鱼和昆明鼠免疫攻毒试验结果

如表3所示，斑马鱼免疫保护率测定结果显示，灭活全菌体HF3和HF2分别为86.7%和80%，BZ1、XC1、BB1分别为66.7%、60%和60%，而HF1为40%；昆明鼠免疫保护率测定结果显示，灭活全菌体HF2和BZ1均为100%，BB1、HF1、HF3均为60%，而XC1为40%。

表1 受试菌株对斑马鱼和昆明鼠的致死作用Table 1 Lethal effect of tested strains in zebrafish and Kunming mice

表2 受试菌株免疫昆明鼠和兔血清IgG抗体检测结果Table 2 Determination of serum IgG antibody in Kunming mice and rabbit immunized with tested strains

表3 受试菌株灭活全菌体对斑马鱼和昆明鼠的免疫攻毒试验结果Table 3 Determination of immune challenge test of tested strains inactivated whole bacteria to zebrafish and Kunming mice

2.3 稳定性试验结果

如表4所示，BZ1传至第10代、20代和30代时，斑马鱼和昆明鼠的LD50均处于上升趋势；HF3在10代内对斑马鱼和昆明鼠的LD50分别为9.77×104CFU·mL-1、2.19 ×109CFU·mL-1，传至第30代均趋于稳定；HF2在10代内对斑马鱼和昆明鼠的LD50分别为7.76×103CFU·mL-1、1.07 ×109CFU·mL-1，传至第30代均趋于稳定。

如表5所示，30代内制备的BZ1、HF3和HF2灭活全菌体免疫接种昆明鼠均可诱导其产生特异性抗体，其中BZ1的血清抗体效价由第10代的1∶12 800下降至第30代的1∶6 400；HF3和HF2的血清抗体效价均由第10代的1∶51 200下降至第30代的1∶12 800。

如图1所示，HF2和HF3在第10～30代对斑马鱼的免疫保护率分别为66.7%～60%和80%～60%，始终高于BZ1，BZ1在第30代对斑马鱼的免疫保护率降至53.3%。HF2和HF3在第10～30代对昆明鼠的免疫保护率分别为100%～80%和80%～60%，始终高于BZ1，BZ1在第30代对昆明鼠的免疫保护率降至40%。

3 讨论

自上世纪50年代起，对猪链球菌病的研究就从未间断。在宿主对抗猪链球菌感染过程中，细胞免疫和体液免疫发挥重要作用[14]，其中疫苗免疫接种作为防控猪链球菌病的有效措施，目前主要包括灭活疫苗和弱毒疫苗。弱毒疫苗诱导的抗体持续时间长、产生速度快，但存在毒力返强的风险，且易受抗生素和母源抗体的干扰；灭活疫苗相对稳定，可用于制备多联疫苗，且不易受母源抗体干扰[15]，但存在抗体维持时间短、抗原性低等缺陷。制苗用菌株的特性与细菌灭活疫苗的免疫效果密切相关，即在菌株信息完备和生物学特性典型的基础上，不仅需要菌株的致病力强、抗原性好，同时在传代过程中表现出遗传性状的相对稳定[16]，因此需要通过致病力、抗原性和稳定性试验综合确定细菌灭活疫苗用菌株。

表4 第10、20、30代BZ1、HF3、HF2对斑马鱼和昆明鼠的LD50Table 4 10th， 20th， 30th generations of the BZ1、HF3、HF2 on LD50 of zebrafish and Kunming mice

表5 第10、20、30代灭活全菌体免疫昆明鼠血清IgG检测结果Table 5 Determination of serum IgG antibody in Kunming mice immunized with 10th， 20th， 30th generations of inactivated whole bacteria

A, 斑马鱼； B, 昆明鼠。A, zebrafish; B, Kunming mice.图1 HF2、HF3、BZ1对斑马鱼和昆明小鼠的免疫保护率Fig.1 Immune protection rate of HF2， HF3， BZ1 on zebrafish and Kunming mice

衡量病原微生物致病力或毒力强弱的重要指标之一是半数致死量(LD50)[17]。本试验由43株SS2临床分离株，通过斑马鱼和昆明鼠致病力试验筛选出6株受试菌株，其中BZ1、HF2、HF3的LD50在2种试验动物上皆低于BB1、XC1、HF1，显示出更强的致病力。本研究中6株受试菌株对斑马鱼的LD50均低于昆明鼠，表明斑马鱼较昆明鼠更适合作为动物模型研究SS2，与Zaccaria等[18]关于斑马鱼可以评估SS2菌株毒力的报道相一致。

抗原性是制苗用菌株的重要指标，其中免疫原性是指机体被免疫抗原刺激产生致敏淋巴细胞和抗体的特性，常通过动物免疫攻毒试验计算免疫保护率来表示，而反应原性是指抗原与相应的效应性淋巴细胞或抗体发生特异性结合的特性，常利用体外血清学方法测定抗体效价来表示[19]。本研究中，免疫灭活全菌体BB1、BZ1、HF2和HF3产生的IgG抗体效价优于XC1和HF1，表现出较好的反应原性，其中灭活全菌体BZ1、HF2、HF3对斑马鱼和昆明鼠的免疫保护率均最高。ELISA检测抗体水平的特异性和灵敏度受到包被抗原质量的决定性影响[20]。本研究分别以重组SLY和AH10-8株全菌体超声裂解物作为包被抗原测定抗体效价，结果显示后者的抗体效价值更高，可能原因是全菌体超声裂解物相较于重组SLY包含的抗原种类更多，刺激机体产生的IgG更加全面，作为包被抗原的结合反应特异性和灵敏度均优于单一重组SLY。根据致病力和抗原性测定结果，最终筛选出BZ1、HF2和HF3等3株受试菌株进行稳定性试验。

稳定的遗传性状是制苗用菌株安全、有效和高产的重要保证，主要包括抗原性和致病力等方面[21]。本研究中，BZ1、HF2、HF3从0代传至第10代对斑马鱼及昆明鼠的致病力均有所减弱，其中BZ1传至第20、30代时仍呈现下降趋势，而HF2、HF3则趋于稳定。由于SS2的体外培养环境相较体内存在较大差异，某些毒力因子的表达受特定的体内条件限制，连续的体外传代可能抑制了某些毒力因子的表达，导致其毒力减弱[22]，其中HF2、HF3相较于BZ1在传至10代后适应了培养基环境，毒力逐渐趋于平稳。同时HPS毒力与抗原性呈正相关[23]，表明HF2、HF3的抗原稳定性优于BZ1，能够为昆明鼠提供更好的免疫保护。灭活全菌体HF2、HF3的血清抗体效价和免疫保护率均高于同代的BZ1，具有较好的反应原性和免疫原性，其中在10代之内，HF2、HF3抗原性稳定，之后与BZ1均开始下降。分析原因，一方面是SS2的免疫原性易受人工培养基中pH值和营养成分的影响，造成疫苗菌株免疫效力的降低[24]；另一方面，SS2在体外连续传代过程中部分组分发生改变以及菌体损伤的出现，致使诱导机体产生致敏淋巴细胞和抗体的能力减弱[24]。综合分析显示，HF2和HF3不仅拥有较强的致病力和抗原性，同时在稳定性试验中能够维持优良的遗传性状，适合作为SS2制苗用菌株。

本研究选用6株临床分离的SS2强菌株，基于制苗用菌种的鉴定要求和选择标准，通过致病力、抗原性以及稳定性试验综合筛选出HF2和HF3作为SS2制苗用菌株，从而为研制具有更佳免疫保护性的灭活疫苗及其多联、多价疫苗提供技术支撑。