免疫佐剂的作用机制及分类

邓博 马兵 刘丹 冷希岗 刘兰霞

中国医学科学院生物医学工程研究所，天津300192

0 引 言

免疫佐剂是指可以非特异性增强免疫应答强度或改变免疫应答类型，但自身却无抗原性的制剂。由于多数情况下机体的自发性肿瘤免疫原性很弱，且容易诱导产生肿瘤免疫逃逸现象，导致机体对肿瘤出现免疫耐受。而免疫佐剂可通过增强肿瘤抗原的免疫原性、促进肿瘤抗原提呈进而诱发机体产生特异性抗肿瘤免疫应答，故免疫佐剂在肿瘤免疫疫苗的发展中具有重要意义。

1 免疫佐剂的作用机制

免疫佐剂的作用机制不尽相同，根据其作用特点可大致分为以下4 类。

1.1 抗原存储库效应

长期以来，疫苗注射位点的抗原存储库效应一直被认为是免疫佐剂的主要作用机制之一。大量研究结果表明，佐剂可通过在注射位点存储抗原并进行缓慢释放，达到对免疫系统持续刺激的目的，从而提高免疫反应。例如铝盐佐剂是将抗原与佐剂成分混合成凝胶状态，当混合后的铝盐佐剂被注入机体后，会在体内形成一种“存储库”，这些不溶性凝胶状颗粒可吸附并分散抗原物质，使抗原的表面积增加，在注射部位形成一个肉芽肿。肉芽肿中的抗原会缓慢渗透入机体中，将原本仅能在注射部位短暂停留的抗原保存数周之久，达到长时间持续刺激免疫系统的目的。

存储库效应一直被认为是所有佐剂发挥作用的必需机制。直到近些年，研究者发现并非所有的免疫佐剂被注入人体后均会形成存储库。Hutchison等[1]利用荧光标记角鲨烯和抗原，并对其肌肉注射部位进行监视，分别于注射后6 h 和120 h 取样。测定结果显示，注射后6 h，只有10%的角鲨烯和25%的抗原物质仍停留于注射部位；注射后120 h，仅剩5%的角鲨烯和0.05%的抗原物质停留于注射部位，表明MF59 并不能在注射部位产生存储库效应，从而影响抗原在体内的释放以及分布。

上述研究结果表明，虽然存储库效应是免疫佐剂的重要作用机制之一，但并非是所有佐剂发挥作用的必需机制。对于抗原存储库效应，还需继续研究并进一步认识其作用意义。

1.2 激活抗原呈递细胞，增强抗原摄取和呈递

有些佐剂在一定程度上可促进树突状细胞（dendritic cells，DCs）的活化与成熟，增强抗原呈递。佐剂不仅可促进抗原呈递细胞（antigen-presenting cells,APCs）的活化与成熟，还可激活共刺激因子CD80 与CD86 的表达以及多种细胞因子的分泌。近年来人们发现，多种类型佐剂均具有类似作用。例如铝佐剂可通过增强DCs 对抗原的摄取，改变抗原呈递的作用时间及作用强度，最终达到增强免疫反应强度的目的。与此同时，DCs 表面的脂类化合物还可与铝佐剂结合，通过降低对DCs 所摄抗原的降解提高APCs 对抗原的利用效率。MF59 不仅可作为运输抗原的递送系统，增强胞吞胞饮作用，还可通过刺激免疫细胞产生多种细胞因子，进而促进免疫细胞对抗原的摄取呈递，激活局部免疫反应。此外，一些新型佐剂例如CpG-ODN，不仅可直接影响APCs的活化与成熟，还可通过作用于B 细胞、自然杀伤（natural killer，NK）细胞等免疫细胞使其分泌细胞因子，间接促进APCs 活化，增强抗原摄取呈递能力，诱导免疫反应的产生[2]。

1.3 增强多种细胞因子表达，促进免疫细胞向注射位点募集

近年来，许多研究者发现一些佐剂可促进包括黏附分子、趋化因子在内的多种细胞因子分泌[3]，并可诱导体内的固有免疫细胞向注射位点募集。MF59、Toll 样受体9 和铝佐剂等免疫佐剂均可在一定程度上调控趋化因子、黏附分子、固有免疫受体、细胞因子等基因的表达。其中MF59 不仅可诱导单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、DCs 等免疫细胞向疫苗注射位点募集，产生局部免疫活性环境，而且在注射位点，MF59 对黏附分子、趋化因子等相关基因的上调作用亦十分显著。

佐剂可通过上调多种细胞因子的表达水平达到迅速产生强烈免疫反应的目的。虽然目前已发现多种佐剂可使免疫细胞向注射位点募集，但募集原理以及募集而来的免疫细胞如何发挥作用仍不明确，还需进一步的研究证明。

1.4 激活炎性小体

炎性小体是细胞内的一种多蛋白聚合物，其属于 NOD 样受体家族（NOD-like receptors，NLRs）。NL-RP3 是炎性小体的成员之一，可识别传递入胞内的危险信号。当铝佐剂随疫苗共同被注射入小鼠体内后，会引起注射位点的组织坏死，同时还会产生尿酸；机体在上述作用下会发出危险信号，此时NL-RP3 可识别危险信号，介导caspase-1 活化，刺激白细胞介素 18（interleukin-18，IL-18）、IL-1β 和 IL-33的分泌[4]。值得注意的是，铝佐剂对炎性小体的激活作用并非在所有情况下均有效，其激活效果可能与铝盐佐剂的组成及所用小鼠的品系等因素有关，具体的作用机制尚未完全阐明，还需进一步研究。

2 传统佐剂

2.1 弗氏佐剂

弗氏佐剂（Freund′ s adjuvant，FA）为标准的抗原传递系统佐剂，通过诱导体内细胞因子的表达从而介导体液免疫和细胞免疫的产生，进而发挥佐剂作用。FA 一般分为弗氏完全佐剂（Freund′s complete adjuvant，FCA）和弗氏不完全佐剂（Freund′s imcomplete adjuvant，FIA）两类。其中 FCA 可诱导 Th1 型细胞因子的表达，激发机体的体液免疫和细胞免疫，而FIA 只能通过诱导Th2 型细胞因子的表达激发机体的体液免疫。FA 因其极高的佐剂活性而被广泛用于科研工作中，但严重的不良反应限制了其临床应用。目前除少数兽用疫苗如口蹄疫疫苗使用FIA外[5]，FA 极少用于动物免疫[6]。FA 的主要不良反应表现在：①FA 制成疫苗后溶液黏稠，不易保存和注射。②FCA 含有分枝杆菌，会在结核素检查中呈阳性反应。③FA 含有油性成分，局部易形成无菌性囊肿，造成组织损伤。

2.2 油乳佐剂

油乳佐剂是最早被人们关注的佐剂之一，是由乳化剂和油类物质按特定比例混合而成。油乳佐剂一般分为油包水（W/O）型乳剂和水包油（O/W）型乳剂。这两种类型的油乳佐剂各有其特点，油包水型乳剂可在注射位点形成存储库，长时间持续刺激免疫系统，但其质地黏稠，易对组织造成伤害，安全性较低；水包油型乳剂的安全性相对较高，但其佐剂活性弱，作用效果较差。

针对油乳佐剂的上述问题，可将毒性较大的矿物油换成可在体内代谢排出的可代谢油，以此来制备更加安全高效的油乳佐剂。MF59[7]作为新型水包油型纳米油乳佐剂，很好地解决了传统油乳佐剂毒性大的问题。MF59 是由司盘85 和吐温80 制得的水包鲨烯乳剂，主要通过激活机体的Th2 型体液免疫应答反应来发挥佐剂作用，同时也可在一定程度上提高机体的细胞免疫水平。经研究结果证实，MF59 发挥作用主要是依赖于凋亡相关的斑点样蛋白通路和髓样分化因子88，MF59 可通过增强APCs的抗原呈递作用，刺激APCs 向淋巴结迁移，诱导免疫相关基因的表达，在注射位点产生免疫激活性的局部微环境[8]。另外，作为流感的高发人群，老年人的自身免疫力较弱，流感相关并发症的发病率高，常规疫苗往往达不到很好的效果。为此一些研究者对新型MF59 佐剂流感疫苗进行了相关系统性评价。临床试验结果显示，在老年患者接种此类疫苗后，慢性阻塞性肺疾病、急性冠状动脉粥样硬化等流感并发症的预防成功率达80%以上，远超同类型的其他疫苗[9]。与此同时，MF59 还是继铝盐佐剂之后唯一被欧盟批准可作为人用佐剂用于流感疫苗中。

2.3 铝盐佐剂

铝盐佐剂是指含有Al3+的无机盐，常以Al（OH）3、AlPO5等形式存在。因其成本低、使用便捷、毒性小等优点，已在世界范围内得到广泛应用，同时其也是最早被应用于临床的免疫佐剂。研究结果发现，Al3+可激活细胞内源性免疫应答相关的Nalp3 炎性复合体，从而诱导巨噬细胞分泌IL-18、IL-1β 等促炎症因子。进一步的研究结果显示，Al（OH）3佐剂可激活 Th2 细胞分泌 IL-4 因子，通过上调 CD86、CD83 等细胞因子和主要组织相容性复合体-Ⅱ类分子的分泌，从而刺激机体产生Th2 型体液免疫应答。虽然铝盐佐剂的用途广泛，但仍存在一些缺陷。如在实际应用中，铝盐佐剂会首先于脑部沉积，对神经系统造成一定损伤，还可能在注射部位出现轻度局部反应，形成肉芽肿；铝盐佐剂仅对体液免疫有明显的激活作用，对细胞免疫的激活作用并不明显；相比于大多数佐剂来说，铝盐佐剂的佐剂活性较弱，对许多抗原的佐剂效果并不明显[10]。

近年来，随着免疫学、细胞分子学等学科的高速发展，对于铝佐剂的剂型及作用机制的研究也愈发深入。联合佐剂[11-12]和纳米铝佐剂成为铝佐剂改良最热门的两个研究方向，深受研究者们的重视。AS04 作为联合佐剂的代表，也是目前世界上使用最广泛的乙型肝炎病毒疫苗，其由Al（OH）3、单磷酰脂质体A 和两种乙型肝炎病毒型蛋白组成，其中单磷酰脂质体A 为Toll 样受体4 激动剂，可促进细胞因子的分泌，增强疫苗引发的免疫反应，使疫苗具有良好的免疫原性。与铝佐剂相比，AS04 的使用剂量较少、免疫刺激效果好，很好地弥补了铝佐剂易出现局部不良反应、活性较弱的问题。纳米铝佐剂具有粒径小、吸附能力强、吸收迅速、炎症反应轻、起效快等优点，被研究者们广泛研究，但尚未应用于临床。研究结果还发现，在不影响佐剂活性的前提下，纳米铝佐剂可于121 ℃下灭菌30 min，这为其在未来生产研发过程中的安全性提供了很大保障[13]。在作用机制方面，系统生物学的进步为Al（OH）3类佐剂的作用机制研究开辟了新途径。根据接种途径的不同，Al（OH）3佐剂可增强Th1 和Th2 型细胞免疫反应[14]。这些将有助于拓展Al（OH）3为基础的佐剂研究的新领域，包括改进配方、使用纳米Al（OH）3和开发联合佐剂等。

3 新型佐剂

3.1 脂质体

脂质体是由脂质双分子层构成的囊泡球型微粒，粒径从几微米到一百纳米不等。其可作为疫苗载体促进APCs 对抗原的摄入，激发免疫应答反应[15]。已有研究结果显示，当脂质体作为佐剂时，白喉类毒素疫苗在动物实验中产生的免疫应答强度比无佐剂情况下高4～6 倍。脂质体可通过与巨噬细胞的细胞膜融合，使疫苗中的抗原成分进入细胞质中，从而增强巨噬细胞的抗原呈递功能。此外，脂质体还可诱导IL-2 基因的表达，促进B 细胞增殖，诱导体液免疫产生。

脂质体主要由胆固醇和磷脂构成，故具有良好的生物相容性和结构稳定性，在作为疫苗传递系统型佐剂时具有天然的优势。对脂质体进行特殊处理，可使脂质体疫苗的效果得到不同程度的提高。可采用 2′，3′-双脱氧腺苷、1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸和二甲基氨基乙烷-氨基甲酰基-胆固醇制备新型阳离子脂质体疫苗[16-17]。文献报道，与普通 2′，3′-双脱氧腺苷-脂质体疫苗相比，阳离子型脂质体疫苗可更好地诱导黏膜和阴道等部位的局部免疫反应，增强免疫反应强度[18]。同样的情况还发生在经鼻接种的CAF01 型疫苗中，当阳离子脂质体作为佐剂用于疫苗时，CAF01 接种小鼠较无佐剂疫苗接种小鼠会产生更强烈的T 细胞免疫反应，其脾脏产生的抗原特异性干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）应答水平较无佐剂疫苗接种小鼠高4倍[19]。由此可以看出，不同类型的脂质体作为佐剂的效果亦不同，不同类型脂质体对于不同种类疫苗的佐剂效果还需进一步验证。

3.2 中药佐剂

中药为近些年免疫佐剂研究的重要方向之一，具有毒副作用小、不良反应少、依赖性低等优点。随着对中药成分的研究深入，越来越多的中药成分被证实具有良好的佐剂活性。一般来讲，中药佐剂分为复方类、多糖类和皂苷类3 种。

中药复方种类繁多，其中有许多具有良好的佐剂活性。研究结果证明，金鸡散、四君子汤、玉屏风散等复方中药均具有激活免疫系统、增强机体免疫功能的效果。

中药多糖[20]在体内是一种良好的生物反应调节剂，可在免疫系统中发挥巨大作用，不仅可激活细胞毒性 T 淋巴细胞、NK 细胞、T 细胞、B 细胞等免疫细胞，还可活化补体系统，促进多种细胞因子的生成。研究结果发现，从当归中提取分离的当归多糖可作为免疫佐剂用于乙型肝炎疫苗中。与Al（OH）3凝胶佐剂相比，当归多糖具有毒性小、有效剂量范围宽等优点，还可显著增强注射者体内的体液免疫水平。复合多糖作为当下多糖类佐剂的研究热点，受到许多研究者的关注。张琦等[21]采用125I 粒子植入术联合支气管动脉化疗药物灌注术（BAI）治疗伴有4R 组淋巴结转移的非小细胞肺癌患者，同时辅以黄芪多糖注射液治疗，其临床疗效显著优于单独采用BAI 组。

中药皂苷[22]是一种甾体或三萜配糖类物质，主要存在于天然植物中，也有少部分皂苷存在于细菌和一些低等海洋生物中。从天然植物中提取纯化而来的皂苷类物质具有一定的佐剂活性。研究结果发现，细胞膜上的胆固醇成分可与皂苷结合形成复合物，复合物具有增强巨噬细胞吞噬、促进淋巴细胞发育增殖、提高NK 细胞杀伤活性等功能。皂苷佐剂与禽流感疫苗、口蹄疫疫苗等疫苗联用时具有良好的佐剂活性，可大大增强疫苗的抗原性。文献报道，当人参皂苷Rg1 作为滴鼻免疫佐剂用于小鼠时，可有效促进小鼠中性粒细胞数量的增加、多种类型细胞因子（Th1、Th17 等）的分泌以及局部黏膜免疫反应的发生[23]，这为局部免疫疫苗佐剂的选择提供了新思路。

3.3 小分子多肽佐剂

小分子多肽佐剂[24]是指一些氨基酸残基数目少于50 且具有佐剂活性的小分子多肽，因其具有制备简单、便于储存运输、安全性高、生物相容性好等优点，近些年被大量用于新型疫苗的研究中。小分子多肽佐剂一般分为自组装肽佐剂、非自组装肽佐剂和防御素3 类[25]。

目前，对于自组装肽佐剂的研究较为深入。Chesson 等[26]将两亲性短肽 Q11（QQKFQFQFEQQ）与卵清蛋白的T 细胞抗原表位相连接，形成的复合物卵清蛋白-Q11 可诱导强烈的免疫应答反应，且与铝佐剂、油乳佐剂不同，该小分子多肽佐剂并不会导致机体产生相关炎症反应。更为重要的是，Pompano 等[27]发现，小分子多肽佐剂可与不同的T细胞表位结合，从而诱导产生不同类型的免疫反应。因此在设计新型疫苗时，可通过调节自组装肽佐剂与抗原表位的比例，构造出可选择性激活细胞免疫应答或体液免疫应答的“定向疫苗”。

Hp91 作为高迁移率族B1 蛋白的衍生肽佐剂，属于非自组装肽佐剂。将Hp91 与HPV16 E7 同时免疫小鼠，可显著增强小鼠体内IgG2a 及IFN-γ 的分泌，诱导抗体产生，增强体液免疫应答反应，显著降低小鼠的成瘤率[28]。

除了上述两种小分子多肽佐剂外，防御素近年来也被证实具有良好的佐剂活性。β-防御素（β-defensin，BD）是一种阳离子抗菌肽，含有6 个Cys，对细菌、病毒、真菌等病原体均具有较强的杀伤活性。有研究结果显示，人BD3 含有43 个氨基酸残基，可使人体皮肤的获得性免疫或固有免疫应答一体化，是良好的内源性皮肤免疫佐剂[29]。

小分子多肽佐剂为新型疫苗的研发提供了许多研究思路。目前学术界对于自组装肽纳米纤维佐剂的研究较为深入，但对于非自组装肽佐剂的研究很少，相关问题尚待进一步研究。

3.4 细胞因子佐剂

细胞因子是由T 细胞、B 细胞、巨噬细胞等免疫细胞以及表皮细胞、内皮细胞、纤维母细胞等非免疫细胞受到外界刺激后合成分泌的一种细胞调节蛋白[30]。目前，研究者已对多种细胞因子的佐剂效果展开了研究。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony factor,GM-CSF）是研究最多的细胞因子佐剂之一，其不仅可诱导APCs 的分化与成熟，提高其抗原呈递能力，增强初级免疫应答反应强度，还可帮助免疫细胞识别肿瘤细胞，引发系统产生肿瘤清除反应。Miguel 等[31]将GM-CSF作为免疫佐剂用于黑色素瘤疫苗中，结果显示GMCSF 较其他细胞因子可产生更为持久高效的抗肿瘤效果。IL 和IFN 在肿瘤疫苗中亦具有良好的佐剂活性。IL-2 可抑制Th2 型细胞的分化与增殖，诱导Th1型细胞大量增殖，产生特异性细胞免疫应答。在临床试验中，将含有IL-2 的gp100 多肽疫苗注射入晚期黑色素瘤患者体内，可显著提高患者的生存期。IFN-γ 作为应用最多的细胞因子佐剂，可增强NK细胞和B 细胞的活性，产生高水平体液免疫。此外，IFN-γ 还可抑制丙型肝炎病毒的复制，这为肝炎疫苗的研发提供了新思路。

相比于其他免疫佐剂，细胞因子佐剂的优势在于种类繁多、免疫调节功能多种多样、生物相容性高，可以较低的不良反应较为全面地调节免疫系统功能。作为佐剂，细胞因子既可使用表达该细胞因子的重组质粒，也可直接使用其重组蛋白，这使其在DNA 疫苗的研究与临床转化中具有巨大的应用前景。

3.5 纳米佐剂

近年来随着生物纳米材料的兴起，基于纳米材料的免疫佐剂也成为人们研究的重要方向。纳米佐剂是指由粒径在1～100 nm 的超微粒子构成的纳米材料制成的免疫佐剂[32]。纳米材料具有粒径小、比表面积大、表面活性中心多、吸附能力强、反应活性高等特点。纳米佐剂在机体中的生物相容性较好，安全性高；具有类似铝佐剂的“存储库”效应，可延长抗原对机体免疫系统的刺激时间，缓释能力强[33]；还可对纳米佐剂的表面性质进行修饰，如引入具有靶向作用的配体，使其可定向运输至目标位置。另有研究结果发现，佐剂材料的表面特性及其粒径大小可能会影响APCs 对抗原的摄取呈递过程以及淋巴细胞在机体内的活跃程度[34]。因此，纳米佐剂相较于其他常规佐剂具有其独特的天然优势，是一类极具研究前景的佐剂。

纳米佐剂一般分为有机纳米佐剂和无机纳米佐剂。有机纳米佐剂有蜂胶纳米佐剂、壳聚糖纳米佐剂、聚丙交酯乙交酯纳米佐剂等；无机纳米佐剂有磷酸钙纳米佐剂、Al（OH）3纳米佐剂等。目前，壳聚糖纳米佐剂和磷酸钙纳米佐剂在研究和临床上应用较多。壳聚糖纳米佐剂对各种类型抗原的负载率均很高，在体内生物相容性好且可自行降解。壳聚糖作为疫苗载体与IL-2 联用时，可有效降低IL-2的降解率，提高疫苗的免疫刺激效果，故其在疫苗运输载体方面具有良好的应用前景。磷酸钙纳米佐剂具有生物安全性高、毒副作用小等优点，是理想的佐剂类型。但受磷酸钙合成工艺技术的限制，磷酸钙纳米佐剂尚无法大量用于临床中，该问题还有待研究解决。

聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA] 作为近些年新兴的纳米材料在对免疫系统的促进方面展现出非凡的潜力。将PLGA 纳米微粒与黑色素瘤抗原肽制成纳米颗粒并使其与DCs接触，通过共聚焦显微镜和流式细胞仪可观察到纳米颗粒被DCs 有效摄取，且DCs 及其效应细胞分泌的IFN-γ 等细胞因子明显增多，表明PLGA 纳米微粒可有效促进DCs 的活化，提高DCs 的免疫应答能力[35]。

纳米佐剂相比于其他佐剂的优势在于缓释功能好、吸附能力强、靶向性高及毒性低。目前，可通过将铝佐剂等传统佐剂制成纳米佐剂，来改善传统佐剂的不良反应大、免疫调节功能单一等缺陷[36-37]。相信随着对于纳米佐剂的进一步研究，纳米佐剂定会在肿瘤免疫治疗中发挥更大的作用。

4 展 望

理想的免疫佐剂应具有毒性小、效力高、不良反应小、持续时间长、生产成本低等特点。相比于铝盐佐剂和FA 等传统佐剂，脂质体、小分子多肽、纳米材料等新型佐剂在实验研究和临床转化中更具有优势。随着对于免疫佐剂的研究深入，研究者们一方面应从机体自身的固有免疫和获得性免疫功能入手，尽可能多地了解不同类型佐剂的作用机制；另一方面，对于已有佐剂潜在的安全问题，研究者们需在完善已有佐剂不足的同时寻找低毒高效、制造成本低、有望用于临床的新型佐剂。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突