天然来源免疫佐剂的研究进展

马兵 邓博 刘丹 冷希岗 刘兰霞

中国医学科学院生物医学工程研究所，天津300192

0 引 言

为阻止病原菌对机体的侵害，人们将病原微生物及其代谢产物经人工减毒、灭活或利用基因工程等方法，制成用于预防传染病的自动免疫制剂，并称之为疫苗。经过处理的病原菌仍保留着能刺激机体免疫系统的特性，当机体与之接触后，免疫系统会产生一些保护物质如细胞因子、免疫细胞等，之后当机体再次接触这种病原菌时，机体会依照原有记忆快速、大量地制造更多的保护物质来保护机体。然而人造疫苗常出现抗原免疫原性较弱、引发的免疫应答强度不够和不良反应较严重等问题，于是人们开始研制相应的佐剂用以解决这些问题[1]。

佐剂是一种非特异性免疫增强剂，当其与抗原同时或预先注入机体时可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。佐剂仅与少量抗原联合使用，即可协助抗原引发更快速、更强烈且更持久的免疫应答反应，因此还可节约疫苗的生产成本。佐剂能激活抗原提呈细胞（antigen-presenting cells,APCs），并能促进APCs 摄取抗原，刺激各种趋化因子和细胞因子的分泌，使CD4+T 分化为辅助性T 细胞 1（helper T cell 1，Th1）、Th2、Th17 等不同类型的细胞，从而引起下游的特异性免疫应答[2]。佐剂还可使免疫应答对主要组织相容性复合体Ⅰ类（major histocompatibility complex class Ⅰ,MHCⅠ）或 MHC Ⅱ和Th1 或Th2 类免疫反应产生选择性调节，这对机体抵抗细胞内病原菌（如细菌、病毒和寄生虫）所致疾病具有非常重要的作用[3]。

佐剂可从自然界的天然产物中直接获取，也可通过人工合成寻求新的类型。自然界中神秘而又丰富的资源为佐剂研究提供了一个巨大宝库。本文将对一些已被发现和使用的天然来源的免疫佐剂进行综述，主要包括植物来源、动物来源和微生物来源的免疫佐剂，论述它们的作用与临床应用进展。

1 植物来源的免疫佐剂

1.1 皂苷

皂苷是苷元为三萜或螺旋甾烷类化合物的一类糖苷，具有多种生物活性和药理活性。值得注意的是，皂苷可激活哺乳动物的免疫系统，这使其作为免疫佐剂有着巨大的开发潜能。其中应用最广泛的是从皂树皮中提取的Quil A 及其衍生物QS-21，已在大量临床试验中得以验证[4]。它们能特定地激活Th1 免疫应答，并促进细胞毒性T 淋巴细胞的产生来对抗外源性抗原，还可以诱导树突状细胞（dendritic cells,DCs）的成熟[5]。这使得它们成为制备某些疫苗或亚单位疫苗的理想材料，可用于直接杀灭胞内病原菌，也可用于制备抗癌疫苗。然而，此类皂苷用作佐剂存在许多严重的缺陷，如含有剧毒、产生溶血反应及在水相中稳定性差等，这些不良反应限制了其作为疫苗佐剂的应用[6]。于是，人们对来自其他天然产物的皂苷佐剂展开了大量研究。

人参中含有大量的人参皂苷，人参皂苷是人参的主要活性成分。研究结果发现，人参皂苷作为免疫佐剂也具有良好的效果。其中人参皂苷Rg1 可通过刺激 IgG、干扰素-γ（interferon-γ,IFN-γ）和白细胞介素-4（interleukin-4,IL-4）的产生，来增强小鼠对乙型肝炎表面抗原HBsAg 的免疫应答[7]，还可激活DCs，诱导针对淋巴瘤的保护性细胞反应[8]；人参皂苷Rg3 可用作常规癌症治疗的佐剂，发挥协同作用提高疗效和减少不良反应，这是通过诱导IFN-γ 和IL-2 的生成来实现的[9]；人参皂苷GS-R/菜籽油乳剂作为佐剂用于口蹄疫病毒疫苗中，能显著增强Th1/Th2 免疫应答，与商业油佐剂ISA 206 相比无显著差别且黏度更低[10]。

除人参皂苷外，还有其他皂苷亦可用作免疫佐剂。Sun 等[11]从合欢的茎皮中提取总皂苷（AJSt），AJSt75 是其中最具辅助活性的部分，可通过在注射部位诱导细胞因子和趋化因子来改善抗原特异性的细胞和体液免疫反应，同时引发Th1/Th2 反应。为了增强亚单位疫苗的免疫原性，Zhao 等[12]将卵清蛋白（ovalbumin,OVA）与桔梗皂苷共同载入脂质体中，再加入可溶性微针阵列中。该抗原佐剂递送系统不仅可大大提高小鼠骨髓来源的DCs 对OVA 的吸收，降低桔梗皂苷的毒性，还可引起小鼠平衡的Th1和Th2 体液免疫反应，增强小鼠的免疫应答。除此之外，还有更多不同种类的皂苷及其衍生物在佐剂方面的应用需要继续探索开发。

1.2 多糖

植物多糖，又称植物多聚糖，是植物细胞代谢产生的聚合度超过10 的聚糖，在自然界中普遍存在，包括淀粉、纤维素、多聚糖和果胶等。天然多糖具有内在的免疫调节、抗肿瘤和降糖降脂等功能，其生物相容性和生物可降解性良好，低毒且安全。近年来，许多研究结果均证实植物多糖可用作免疫佐剂。多糖佐剂可激活巨噬细胞、T 淋巴细胞、B 淋巴细胞和自然杀伤（natural killer,NK）细胞，并促进免疫相关分子（如细胞因子、抗体和补体分子）的分泌，以增强体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫，达到杀伤肿瘤的作用[13]。多糖佐剂主要包括壳聚糖、葡聚糖、甘露糖等。

壳聚糖（chitosan）颗粒可增加 IL-1b、IL-6 和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的释放，并促进CD4+T 和CD8+T 细胞的增殖分化，有效刺激体液免疫和细胞免疫，诱导天然和适应性免疫反应[14]。壳聚糖还具有缓释和控释的作用，可延长抗原或药物在胃肠道中的作用时间。Almasian 等[15]制备了含有大肠杆菌Stx2B 蛋白的壳聚糖纳米颗粒口服疫苗，并用其免疫BALB/c 小鼠，结果证实壳聚糖纳米粒在胃肠道中能保护抗原免于降解并控制抗原释放，被免疫小鼠体内的IgG 和IgA 滴度显著增加。

葡聚糖（glucan）可增强机体对疫苗的免疫应答，提高血清抗体滴度以及 IL-2 和 IFN-γ 的水平[16]。此外，Mirza 等[17]发现葡聚糖颗粒的内部中空腔可装载不同的化合物（包括蛋白质抗原），并输送至巨噬细胞和DCs。因此，葡聚糖既可用作佐剂，又可用作靶向呈递抗原的递送系统。

甘露糖（mannose）的佐剂功能可能取决于其与巨噬细胞和DCs 表面甘露糖结合凝集素和甘露糖受体家族的其他C 型凝集素的结合，从而激活补体，发挥调理吞噬作用。Yang 等[18]将脂质纳米粒与合成的CpG 寡脱氧核苷酸（CpG-ODN）和甘露糖偶联，然后负载H22 肝癌裂解液，开发出一种新型脂质纳米粒M/CpG-ODN-H22 Lipo，该脂质纳米粒可选择性靶向DCs，显著诱导DCs 的成熟，并降低调节性T 细胞的比例，上调脾脏中的IFN-γ 阳性细胞数与血清IgG 水平，有效抑制小鼠肝肿瘤的生长并延长其生存期。

此外，菊粉、黄芪多糖以及当归多糖（angelica sinensis polysaccharide,ASP）等作为免疫佐剂均有着重要应用。Gu 等[19]将 OVA 与 ASP 封装于聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA]纳米颗粒中，结果显示，使用ASP-PLGA/OVA 纳米颗粒免疫小鼠可显著促进淋巴细胞的增殖，提高CD4+T与CD8+T 细胞的比例，同时可诱导强烈的长期IgG免疫应答，并上调Th 相关细胞因子的水平。由此可见，ASP-PLGA/OVA 纳米颗粒可刺激持续而强烈的抗体应答并诱导细胞免疫应答。

1.3 蜂胶

蜂胶是蜜蜂从植物芽孢或树干上采集的树脂，并混入其上腭腺、蜡腺的分泌物加工而成的一种具有芳香气味的胶状固体物。其主要成分为黄酮类、类黄酮类化合物，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤和增强机体免疫功能等生物学作用，是一类良好的疫苗佐剂。蜂胶佐剂具有天然、毒性低、稳定性好、价格低廉等优点。此外，蜂胶在抗肿瘤方面也有着重要作用，其可增强机体的抗氧化状态及对病原体的免疫检测能力，并调节肿瘤微环境[20]。目前，在我国蜂胶佐剂多用于动物疫苗，并取得了显著疗效。希望随着对蜂胶生物学功能研究的深入，可早日将其应用于人类疫苗。

2 动物来源的免疫佐剂

2.1 细胞因子

细胞因子是由多种细胞经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质。其主要化学成分为蛋白质或糖蛋白，具有调节固有免疫和适应性免疫的功能。随着人们对疫苗研究的深入，发现细胞因子能增强疫苗的特异性免疫反应，故其作为一种新型免疫佐剂受到了广泛关注。细胞因子包括IL、IFN、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony factor, GM-CSF）、TNF 和趋化因子等，下文将逐一进行介绍。

2.1.1 IL

IL 是由白细胞分泌的一类细胞因子，也是种类最多的一类细胞因子佐剂。其中，IL-1 最早作为免疫佐剂应用，其可促进B 细胞增殖，提高IL-2 水平，达到增强机体初次和再次免疫应答的目的[21]；IL-2 可调节T 细胞生长，诱导分泌更多的IL-12 和TNF-α并上调免疫应答反应，可用作基于DCs 的免疫佐剂[22]，但其毒性较大，导致应用受限；IL-12 的相对分子质量小，在极低浓度时便具有显著活性，可诱导Th0 细胞向Th1 细胞分化，促进IFN-γ 的分泌，并激活NK细胞和细胞毒性T 淋巴细胞的活性，主要参与机体的细胞免疫[23]；IL-15 主要由巨噬细胞和DCs 分泌，其作用为增强并维持记忆性CD8+T 细胞的功能，并调节记忆性CD8+T 细胞和NK 细胞的数量[24]；IL-18可诱导T 细胞和NK 细胞的活化，NK 细胞进而通过TNF-α 和 IFN-γ 刺激 DCs 产生高水平的趋化因子[25]。

2.1.2 IFN

IFN 由单核细胞和淋巴细胞产生，主要参与机体早期的免疫应答，其可分为 IFN-α、IFN-β 和 IFN-γ 3 类。IFN-α 由 NK 细胞和 T 细胞产生，可通过上调共刺激分子和MHC 分子的表达刺激DCs 的成熟。Zhao 等[26]将 GM-CSF、IFN-α 与重组乙型肝炎病毒疫苗组合制成单一制剂，对小鼠进行4 次疫苗接种后，小鼠血清中的HBeAg 和HBsAg 均被清除，同时乙型肝炎病毒阳性肝细胞减少了95%，且肝脏中浸润着大量CD8+T 细胞。IFN-γ 主要由活化的NK 细胞在IL-12 的共刺激作用下产生，其可提高APCs 表面MHC Ⅱ类分子的表达，并促进抗原提呈给Th 细胞来调控免疫应答[27]。

2.1.3 GM-CSF

GM-CSF 能增强单核细胞、粒细胞、嗜酸性细胞和巨噬细胞的功能，提高机体抗肿瘤及抗感染免疫力，故受到研究者的广泛关注。GM-CSF 还可促进APCs 表达MHC Ⅱ类分子和共刺激分子B7，增强抗原特异性CD8+T 细胞应答。IL-2 和GM-CSF 具有协同效应，在诱导肿瘤特异性免疫反应中发挥重要作用，通过构建IL-2-GM-CSF 融合蛋白，既能维持IL-2和GM-CSF 的生物活性，又能克服两者联合使用的局限性[28]。

2.1.4 TNF

TNF 主要由活化的单核和巨噬细胞产生，具有杀伤和抑制肿瘤细胞的作用。TNF-α 可作为诱导剂刺激机体分泌IL-1 和IL-6 等细胞因子，并参与机体的炎症反应，受到了研究者的广泛关注。文献报道，将LIGHT（TNF 超家族中的一员）质粒与HIV-1 Nef DNA 疫苗对BALB/c 小鼠进行联合免疫，可增强小鼠的特异性免疫反应[29]。

2.1.5 趋化因子

趋化因子是指能吸引白细胞移行至感染部位的一些低相对分子质量的蛋白质，在炎症反应中具有重要作用。除此之外，趋化因子还可调节淋巴细胞的发育。Liu 等[30]采用趋化因子CXCL11 装配了一种肿瘤选择性溶瘤病毒vvDD，vvDD-CXCL11 可诱导脾脏和其他淋巴器官中产生肿瘤特异性IFN-γ 的CD8+T 细胞系统性增加，增强机体系统性抗肿瘤免疫反应，这表明CXCL11 能增强溶瘤病毒和癌症疫苗的治疗效力。Hartoonian 等[31]将CC 趋化因子配体20表达质粒（pCCL20）作为丙型肝炎病毒核心DNA 疫苗的佐剂共同接种BALB/c 小鼠，接种后小鼠体内的IFN-γ/IL-4 比值升高，IL-2 释放增加，小鼠的脾细胞和淋巴细胞均发生增殖，表明CCL20 趋化因子能增强丙型肝炎病毒核心DNA 疫苗免疫中Th1 介导的细胞和体液免疫，是一类有潜力的免疫佐剂。

总的来说，细胞因子在调节天然免疫应答和适应性免疫应答中发挥着重要作用，但其毒性与使用剂量密切相关，且具有免疫原性弱不能有效刺激机体产生免疫应答等缺点，在一定程度上限制了其在免疫佐剂方面的应用。随着对细胞因子研究的深入，可将多种细胞因子联合使用或将细胞因子基因连接至免疫原蛋白的基因上，以提高其佐剂效应。

2.2 DCs

DCs 疫苗旨在诱导或增强针对肿瘤抗原的有效抗肿瘤免疫反应，其特点是采用最强的APCs——DCs 作为疫苗佐剂，促进肿瘤抗原被有效摄取并提供共刺激信号[32]。DCs 疫苗可与细胞因子IL-12[33]或TNF-α[34]配伍使用，将 IL-12 或 TNF-α 基因转染进入DCs，可激发DCs 的免疫刺激和抗原提呈功能，还可逆转DCs 的耐受问题。尽管DCs 疫苗的安全性及其诱导抗肿瘤反应的能力已得到验证，但因缺乏大规模良好的Ⅱ/Ⅲ期临床试验，限制了其临床应用。

3 微生物来源的免疫佐剂

3.1 病毒

病毒样颗粒（virus-like particles, VLPs）不含病毒基因组但保留病毒衣壳结构，其结构与天然病毒颗粒类似。VLPs 具有很强的免疫原性，可通过模拟病毒感染途径来激活机体的免疫系统，产生免疫应答[35]。VLPs 可诱导 DCs 成熟，促进抗原提呈，并分泌IFN 等细胞因子，介导体液免疫。此外，可将VLPs 与其他佐剂灵活结合，若VLPs 自身免疫原性弱，在其表面连接佐剂则可显著增强其免疫效应。Gogesch等[36]以模块化方式将模型抗原OVA 和非经典佐剂GM-CSF 连接在鼠白血病病毒（MLV）衍生的VLPs表面，结果表明OVA 和GM-CSF 的模块化MLV-VLPs能靶向诱导CD11b+APCs 的扩增，促进抗原特异性T 细胞的活化和体外增殖。

3.2 细菌

3.2.1 细菌样颗粒

与 VLPs 类似，细菌样颗粒（bacterium-like particles，BLPs）也是一种无生命活性的球形颗粒，其主要成分为乳酸乳球菌肽聚糖壳。人体的某些固有免疫细胞，如DCs 和巨噬细胞，在与BLPs 混合后能产生细胞因子IL-6 和TNF-α，并可增强这些细胞对BLPs 的吞噬[37]。BLPs 也可作为佐剂结合抗原，通过与Toll 样受体作用来激活机体的固有免疫系统，同时增强抗原特异性黏膜免疫应答和全身免疫应答，是一种良好的黏膜免疫疫苗佐剂。与普通注射疫苗相比，黏膜免疫疫苗无需注射，给药方便，在引起全身免疫应答的同时还能诱导局部黏膜免疫应答，这样不仅可预防机体对病原体的感染，还可减少病原体在局部黏膜定植，更有利于群体免疫[38]。但目前常用的亚单位疫苗多有免疫原性弱的缺陷，可通过佐剂和基于颗粒性的载体系统增强黏膜疫苗的免疫原性。Srivastava 等[39]则选择了具有较强黏膜佐剂活性的霍乱毒素、大肠埃希菌肠毒素和白喉毒素等细菌毒素来增强黏膜免疫抗原的免疫反应性。综上所述，BLPs 通过其出色的抗原展示和免疫激活性质，为黏膜疫苗的研发提供了良好的思路。

3.2.2 细菌芽孢

芽孢杆菌是细菌的一科，其特点是能形成芽孢（内生孢子）来抵抗外界的有害因子。细菌芽孢可用作黏膜和热稳定的疫苗输送系统。由于芽孢表面带有负电荷，且表面层具有疏水性，这为吸附蛋白抗原提供了一个很好的平台。在低pH 条件下，可通过静电作用力和疏水作用力促进孢子与蛋白抗原的结合。Copland 等[40]将枯草芽孢杆菌孢子用含有结合分枝杆菌抗原的融合蛋白1（FP1）包裹，制成疫苗Spore-FP1。与单独使用传统卡介苗的小鼠相比，增加了Spore-FP1 黏膜增强免疫的小鼠体内的Th1、Th17 和调节性T 细胞型细胞因子增多，血清和肺黏膜表面抗原特异性IgG 和IgA 滴度升高，并在肺实质内发现了CD69+/CD103+组织驻留记忆T 细胞。此外，有研究结果发现，灭活的芽孢与活芽孢具有相同的佐剂效应。因此，将芽孢用于改善某些疫苗的免疫原性及递送生物治疗分子具有良好的安全性。

3.2.3 细菌鞭毛蛋白

细菌鞭毛是某些细菌菌体上细长而弯曲的具有运动功能的蛋白质附属丝状物。其所含的鞭毛蛋白作为病原相关分子模式，可通过与宿主的Toll 样受体5 直接相互作用激活先天免疫和适应性免疫；独特的结构特征赋予了其灵活而有效的佐剂活性，可诱导并增强抗原特异性免疫反应[41]。Xiao 等[42]研究了3 种鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白FljB、FliC 和FljB'-FliC 作为狂犬病疫苗佐剂的效用，结果发现，与单独接种狂犬病毒灭活疫苗（whole-killed rabies vaccine, WKRV）或接种具有 FliC 或 FljB′-FliC 的WKRV 相比，FljB 可使WKRV 诱导更强的体液和细胞免疫应答，且用WKRV 和FljB 共同免疫的小鼠产生的针对狂犬病毒的中和抗体水平更高，故FljB 是一种有效的狂犬病疫苗佐剂。Kim 等[43]则发现呈递鞭毛蛋白的病毒样颗粒（Flag VLPs）具有独特的佐剂作用，可诱发对不良免疫原性流感病毒M2e 蛋白疫苗的Th1 型体液和细胞免疫反应，经Flag VLPs 和M2e5x 蛋白疫苗共同免疫的小鼠其血清和黏膜中的IgG2a 同型抗体水平更高，且与明矾佐剂相比，其能诱导产生可分泌IFN-γ 和粒酶 B 的CD4+效应 T 细胞，起到清除肺部病毒和保护的作用。

4 展 望

疫苗是预防和治疗疾病的一种重要手段，佐剂作为一种免疫增强剂，可通过增强机体的免疫应答来抵御外界病原微生物的侵害。天然来源的免疫佐剂大多具有易获取、毒性低、稳定性高等特点。尽管目前许多新型合成佐剂不断出现，但自然界仍是一个值得深入挖掘和探索的宝库，尤其是我国自古便对天然动、植物药材颇有研究，研究人员可借助古人的智慧继续探索。此外，可将天然佐剂进行再加工和处理，改善其靶向性，降低其毒性，还可将几种佐剂联合应用，利用它们之间的协同作用来增强免疫。随着对天然佐剂的深入研究，一定会有更多的研究成果实现临床转化，造福于人类。

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