细胞疗法对椎间盘退变治疗作用的研究进展

王译晗 王佳媛 焦递进 马旭

沈阳市骨科医院重点实验室110044

0 引 言

据报道，超过90%的椎间盘退变（intervertebral disc degeneration）患者年龄在50 岁以上[1]。尽管椎间盘退变属于自然衰老过程，但仍有部分患者会出现由椎间盘退变引起的症状性神经根压迫及慢性背痛[2-3]。然而，药物及物理疗法等保守治疗措施并不能解决椎间盘退变的根本原因，也无法减缓疾病的自然进展。当症状逐渐加剧的患者对保守治疗措施无反应时，则需进行手术治疗。目前，手术治疗方法包括椎间盘切除术及放置骨间融合的椎间植骨等。但因关节假体所致的邻近节段疾病，进而导致症状复发需再次手术的病例屡见报道[4-5]，且上述外科手术干预存在一定的潜在并发症。随着人们在分子和细胞水平上对椎间盘特征理解的逐渐深入，细胞疗法作为椎间盘退变的治疗方法，已逐渐引起了人们的关注。

细胞疗法在医疗领域被快速推进，其治疗领域包括自身免疫性疾病、心肌梗死、脑缺血、肝硬化及脊髓损伤等多种疾病[6-7]。目前，已有多种类型的细胞经体内或体外培养途径用于椎间盘退变的治疗中，适宜的细胞来源、细胞载体及椎间盘内微环境条件等因素对于椎间盘退变的治疗起到关键作用。本文对这些内容进行了概述，讨论了不同的细胞类型及条件用于椎间盘再生治疗的现状及发展。

1 椎间盘退变

椎间盘退行性疾病是腰痛的主要原因，通常随着年龄的增长而发生。椎间盘是由3 种特殊组织组成的复杂结构：外周纤维环、中央髓核及分离椎体的透明软骨终板[8]。椎间盘是体内最大的无血管组织，依赖于营养物质和氧气通过邻近终板的浓度梯度扩散，以维持髓核细胞（nucleus pulposus cells，NPCs）的活力[9]。椎间盘退变是由于连接相邻椎骨的结构损伤导致椎间盘完整性丧失，从而影响椎间盘的减震能力。在此过程中，髓核蛋白多糖含量降低引起凝胶样核基质逐渐脱水，并被纤维软骨取代，进而椎间盘形态发生改变，椎间盘高度降低，造成脊柱不稳定并对脊柱的后部元件产生更大压力[10]。另外，椎间盘退变的形态学改变还与合成代谢和分解代谢过程之间的代谢失衡有关，该过程受多种因素调节，如合成代谢生长因子胰岛素样生长因子-1、转化生长因子β、骨形态发生蛋白及分解代谢酶等，均可导致NPCs 的功能发生变化。而椎间盘固有的无血管性、隔离性和低代谢活性使其在损伤和变性后无法进行自我修复[11]。治疗或预防椎间盘退变的方法在于恢复椎间盘合成细胞外基质的能力，以重建椎间盘水合性及髓核黏弹性的特征，从而恢复椎间盘的生物力学特性。细胞疗法可通过刺激细胞外基质的合成，以及通过细胞与细胞相互作用等途径促进椎间盘的修复再生。

2 细胞疗法的机制

2.1 替代软骨细胞

移植细胞可能主要通过两种机制传递其再生效应。第一种机制是细胞在椎间盘中存活、增殖并分化，充当软骨细胞样椎间盘细胞。这些移植细胞可产生蛋白多糖和胶原，从而弥补椎体退变的缺陷并恢复椎间盘的结构和功能。软骨细胞可直接通过替换耗尽的功能性软骨细胞群来拯救退化的椎间盘，然而对于未分化的干细胞移植如间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）或间质前体细胞（mesenchymal precursor cells，MPCs）等，移植细胞必须首先在椎间盘内经历软骨形成的分化，继而发挥替代作用，在软骨形成条件下MSCs 或MPCs 等可分化成类似于NPCs 的软骨细胞样细胞[12]。另外，Richardson 等[13]的研究结果表明，无论细胞比例如何，当NPCs 和MSCs 无接触培养时，两种细胞中髓核标记基因的表达均无明显变化；当NPCs 和MSCs共培养时，MSCs 中髓核标记基因表达显著增加。因此，共培养是产生大量分化细胞的可行方法。

2.2 旁分泌

移植细胞传递其再生效应的第二种可能机制是旁分泌效应，即移植细胞通过释放可溶性营养因子发挥作用，这些因子可启动或刺激驻留的椎间盘细胞产生椎间盘基质。文献报道，MSCs 和MPCs 能分泌抗炎细胞因子和生长因子[14]，这些因子可增强NPCs 合成新基质，并抑制由机械介导的椎间盘损伤引发的分解代谢事件。Yang 等[15]报道了自体MSCs移植可抑制细胞凋亡，减缓椎间盘高度指数的降低速度，促进椎间盘基质的修复，进一步证实了旁分泌作用机制的理论。此外，外泌体作为细胞-细胞通讯中的重要旁分泌机制一直备受关注。Lu 等[16]发现，外泌体是自体骨髓间充质干细胞（bone marrowderived mesenchymal stem cells，BMSCs）和 NPCs 之间信息交换的重要载体，NPCs 和BMSCs 均分泌外泌体，NPCs 衍生的外泌体可促进BMSCs 迁移并诱导其分化成髓核样表型，而BMSCs 衍生的外泌体可促进退变NPCs 增殖并合成健康的细胞外基质。Cheng 等[17]则发现，BMSCs 衍生的外泌体还可阻止NPCs 进行性凋亡过程，将外泌体miR-21 转入NPCs，可抑制磷脂酶和张力蛋白同源物，激活凋亡NPCs中的PI3K/Akt 途径，从而减轻肿瘤坏死因子-α 诱导的NPCs 凋亡。

3 细胞来源

细胞疗法可有效针对特定的功能障碍进行治疗，而选择适宜的细胞来源是椎间盘细胞治疗成功的必要条件。植入的细胞需能存活并产生足够质量的组织，以满足椎间盘再生的需求。目前，多数研究以髓核作为椎间盘再生或防止椎间盘高度进一步丢失的靶点。用于治疗椎间盘退变的细胞包括NPCs[18]或其他具有盘状潜能的细胞，如软骨细胞[19]和MSCs[20]等。

3.1 软骨细胞

软骨细胞在表型上与NPCs 最为相似，均存在于低细胞、无血管和无神经支配的承重组织中[21]，且具有相似的基因表达模式，如Y 框蛋白9[22]和基质金属蛋白酶[23]等。同时，两者均能产生丰富的细胞外基质，富含聚蛋白多糖和Ⅱ型胶原蛋白（type Ⅱcollagen，COL2）[24]。因此，关节[25]、耳廓[26]、鼻[27]等组织的软骨细胞被认为是椎间盘细胞治疗的可靠来源。

Gorensek 等[26]使用耳廓软骨细胞诱导兔髓核再生，结果证实植入软骨细胞可存活并产生透明软骨。Acosta 等[25]也发现猪同种异体幼年关节软骨细胞可在新形成的组织中产生髓核样组织再生。Gay等[27]将模拟退化的椎间盘生理条件下鼻软骨细胞（nasal chondrocytes，NCs）的组织形成特性与MSCs和关节软骨细胞（articular chondrocytes，ACs）进行比较，结果发现MSCs 在炎症环境中糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAG）和 Col2 的积累明显减少，NCs 在非酸性条件下可积累GAG 和Col2，而补充炎症细胞因子或酸性环境对NCs 的影响程度低于ACs 或MSCs，表明在椎间盘炎症环境中，移植NCs优于移植 ACs 或 MSCs。Vedicherla 和 Buckley[28]比较了NCs 与ACs 作为椎间盘替代软骨细胞来源的细胞产量，结果表明，在氧气体积分数为5%条件下，NCs 仍可保持细胞的增殖能力，并可见大量硫酸化糖胺聚糖（sulfated glycosaminoglycans，sGAG）和较少量胶原积累，同时在椎间盘样微环境条件下培养时，NCs 的成骨和钙化也受到了抑制。

3.2 干细胞

干细胞可通过细胞分裂进行自我更新，并可被诱导发育成不同的特化细胞。干细胞具有来源广泛、免疫原性弱、易于外源基因转染、可于宿主体内长期存活、可跨胚层多向分化等优势，已在各种组织内显示出迁移和移植的能力，并通过多种机制对其他类型细胞发挥刺激作用。这些特征使干细胞成为椎间盘退变细胞疗法更具吸引力的细胞来源。

动物体内研究结果显示，同种异体BMSCs 植入兔腰椎的髓核后24 周，在兔椎间盘组织切片中可检测到BMSCs，表明移植的BMSCs 可存活并成功植入椎间盘组织，同时BMSCs 也是外源基因递送至椎间盘的有效载体[29]。而体外研究结果证实，人NPCs 与人 BMSCs 以 75∶25（细胞数量比）共培养2 周，产生的细胞外基质最多；在BMSCs 和NPCs 共培养条件下，BMSCs 数量逐渐减少，而NPCs 数量逐渐增加，表明BMSCs 可能是通过促进NPCs 增殖起到椎间盘修复的作用，而非通过促进基质形成发挥治疗作用[30]。然而对于干细胞而言，尚存在分化不适当等问题，阻碍了干细胞用于椎间盘退变的治疗。例如BMSCs 可能会遵循成骨向分化途径，Vadalà等[31]发现注射入兔椎间盘中的BMSCs 会导致后期的骨赘形成，表明该法可能会产生一定的不良反应。

3.3 NPCs

髓核退化是椎间盘退变的主要原因，针对NPCs的研究正在引起越来越多的关注。Iwashina 等[32]将人NPCs 移植入兔椎间盘退变模型，发现移植后4 周椎间盘高度明显增高，移植后24 周NPCs 仍存在。Oehme 等[33]发现，移植的NPCs 在椎间盘内可存活8 周至 8 个月，而 MSCs 的存活时间为 2 周至 24 周。Wang 等[34]将表达绿色荧光蛋白的大鼠NPCs 移植入退化的椎间盘中，并于体外将NPCs 与软骨细胞和纤维环细胞（annulus fibrosus cells，AFCs）共培养，结果发现注射NPCs 是通过抑制细胞凋亡和增加细胞外基质来抑制椎间盘退变的发展，NPCs 可在体内迁移至纤维环内部，而体外NPCs 的迁移是由AFCs和软骨细胞共同促进的。这些结果证实了移植入椎间盘内的同种异体NPCs 的抗细胞凋亡作用和迁移能力。此外，由于髓核的营养供应不足，低数量的细胞更有益于细胞的存活，可促使髓核产生最大限度的效应；超过该效应，增加的细胞无法存活，同时死亡细胞和废物的积累反而会产生有害影响[35]。

4 椎间盘内微环境条件

为了确保植入细胞的安全性及有效性，评估植入部位的微环境条件及其对植入细胞的影响十分重要。椎间盘内的微环境条件，特别是退化盘的微环境条件，常不同于可用细胞源的自然环境，即不同于细胞的实验室培养条件。在植入椎间盘之前，细胞群体的扩增方式可能会严重损害细胞的功能，甚至可能导致植入细胞的死亡[36]。椎间盘细胞需在具有足够氧和葡萄糖的细胞外环境生长，且pH 不能为酸性。

上述研究结果表明，椎间盘内严酷的微环境条件对植入细胞具有较大的挑战性，在移植前对移植细胞进行预处理可克服这一难点。Wang 等[40]将大鼠ADMSCs 在软骨形成条件培养基中预分化7～10 d，可促进ADMSCs 在椎间盘样条件下的再生效果，表明预分化过程对椎间盘恶性环境中ADMSCs 的再生具有积极作用。

5 细胞载体

细胞疗法治疗椎间盘退变的成功与否还取决于移植细胞是否获得有效的递送。载体生物材料对于细胞的靶向递送必不可少，可提供关键的生物物理和生物化学作用，促进细胞的分化。

Naqvi 和Buckley[30]评估了藻酸盐和壳聚糖水凝胶对BMSCs 和NPCs 的影响。结果显示，NPCs 在两种水凝胶中均能保持较好的活力，而BMSCs 在壳聚糖水凝胶中活力降低；另外，与壳聚糖水凝胶相比，藻酸盐水凝胶能更好地支持NPCs 和BMSCs 的sGAG 积累及 COL2 沉积。Vadalà 等[41]的研究结果证明悬浮的MSCs 容易渗入周围的椎间盘中，从而导致骨赘形成。而支架在MSCs 移植中的应用可降低细胞渗漏的风险，对临床应用至关重要[42]。Bertram等[43]发现，当细胞以悬液形式注射时，90%的细胞会发生泄漏，而通过与纤维蛋白胶共同给药时，泄露率降至50%。Barczewska 等[44]研究了将悬浮于水凝胶中的MSCs 引入椎间盘的细胞递送方法，发现水凝胶可模仿天然储库环境，为MSCs 的生长和分化提供支架，并为髓核的修复和再生提供条件。Bendtsen等[45]报道，悬浮于水凝胶中的MSCs 可维持血流量、椎骨体积以及椎体终板和软骨下骨的渗透性长达3 个月之久。

6 结 语

由于椎间盘内细胞丢失对人体造成的严重危害，新型椎间盘治疗手段逐渐引起了人们的关注。尽管细胞疗法的细胞来源广泛且移植便捷，但退化细胞种群的次优再生及细胞提取引发的疾病等使细胞疗法受到了明显限制。因此，还需进一步确定细胞的基本性质、移植条件及其对人体的短期和长期毒性，细胞疗法治疗椎间盘退变才有望广泛应用于临床实践。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突