循环肿瘤DNA在肾细胞癌诊疗中的应用进展

庞亮 胡铁良

天津市职业病防治院，天津市工人医院泌尿外科 300011

0 引 言

肾细胞癌（renal cell carcinoma, RCC）是一种高度侵袭性和化疗耐受性的疾病，由于其对放疗的反应也很差，因此通常需通过手术切除来治疗[1-2]。重要的是，治疗后超过30%的患者局部RCC 复发或转移[3]。即使在被认为可通过根治性肾切除术治愈的RCC 病例中，手术后5～10年仍可发生远处转移[4]。在过去的几十年中，使用细胞因子的非特异性免疫疗法已广泛用于治疗转移性RCC，但由于其在提高患者中位生存率方面取得的成功有限，现在正逐渐被靶向免疫疗法取代[5]。目前，在临床实践中常规使用的RCC 靶向疗法，如免疫检查点抑制剂、mTOR 抑制剂或VEGF 酪氨酸激酶抑制剂，但尚未使用预测性生物标志物来指导这些靶向疗法的选择[6]。在这种情况下，迫切需要可靠的RCC 生物标志物，以实现早期诊断、预后和监测治疗效果以及疾病的潜在复发。

近些年，液体活检技术发展迅猛，如：循环肿瘤细胞（circulating tumor cell, CTC）和无细胞核酸（即循环无细胞DNA），循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA,ctDNA），循环无细胞RNA 或细胞外囊泡，已成为监测癌症患者（包括RCC）疾病状态的潜在工具，并受到极大关注[7]。本综述重点对ctDNA 在RCC诊疗中的应用进行综述。

1 ctDNA 分析概述

无组织的DNA 在某些情况下可在血液中释放，如在炎症状态或怀孕时。已经发现，与健康受试者相比，癌症患者的ctDNA 浓度更高[8]。目前尚不清楚ctDNA 如何释放到血液中，但先前的研究表明其来源可能是坏死和/或凋亡引起的细胞裂解[9]。它是肿瘤特异性的，并提供有关肿瘤细胞片段化DNA及其特异性突变的分子线索[10]。随着高通量测序和液体活检技术的迅速发展，血浆中存在的ctDNA 已逐渐成为组织的替代品[11]。ctDNA 中的全基因组拷贝数的不稳定性分析提供了一种合适的方法，从而可量化染色体不稳定性并预测癌症的治疗反应[12-13]。为实现RCC 的早期诊断、预后和监测治疗效果以及疾病的复发提供了有力的支持。

2 ctDNA 的定性分析

Pal 等[14]分析了 220 例转移 RCC（metastatic RCC,mRCC）患者的ctDNA。有79%的患者检测到基因改变，其中最常见的是 TP53（35%）、VHL（23%）、EGFR（17%）、NF1（16%）和 ARID1A（12%），并以单核苷酸变异为主。他们还比较了在一线药物治疗的患者（舒尼替尼和帕唑帕尼）和二线药物治疗的患者（尼古卢单抗，依维莫司，阿昔替尼和卡博替尼）的ctDNA 分析中检测到的基因改变。并注意到TP53（49%vs 24%，P=0.02）、NF1（20%vs 3%，P=0.01）发生了改变。这些发现提出了这样的假设，即某些基因改变可能是治疗中选择性压力的结果，并且可能在治疗耐药性中起作用。

在已知与治疗敏感性相关的分子途径中寻找与指导治疗决策相关的特定突变。对依维莫司的敏感性似乎与TSC1/TSC2/mTOR 改变有关。不论组织学如何，在有临床获益的患者中和非临床获益的患者中均发现了这些突变的发生[15]。Voss 等[16]在5 例mRCC 接受mTOR 抑制剂治疗的患者中，发现在TSC1 和mTOR 中存在对mTOR 信号具有激活作用的基因组改变，此为异常的治疗反应提供了合理的解释。TSC1 和TSC2 可能被筛选为在以VEGF 为靶点治疗的RCC 患者中依维莫司反应的预测生物标志物。

已鉴定了与侵袭性肿瘤行为相关的特定突变或一组突变，如 SETD2（ccRCC 的 15%）、PBRM1（40%）、BAP1（15%）、KDM5C（7%）、MTOR（5%～6%），可以考虑未来使用液体活检来指导治疗相关的mRCC[17-19]。乳头状 1 型 RCC 与 MET 基因改变有关，而乳头状2 型RCC 的特征在于CDKN2A、SETD2、NF2、CUL3，TERT 突变[20]。患有遗传性平滑肌瘤和RCC 综合征的富马酸水合酶基因突变的患者有可能发生2 型乳头状RCC[21]。

3 ctDNA 在局限性肾细胞癌中的应用

尽管25%的RCC 患者在就诊时已出现转移，但另外20%～40%的局限性RCC 患者最终会发展成mRCC 患者[1,22]。RCC 中转移的时间和位置很难预测，这使得监测变得困难。早期发现转移性疾病可能会改善临床结局。ctDNA 有潜力作为肾切除术后局限性RCC 患者的监测生物标志物。Al-Qassab 等[23]研究了一些预后基因以及RCC 中其他常见突变的基因，从而创建了一个由14 个基因组成的小组。在此项针对30 例准备肾切除术的RCC 患者的研究中，ctDNA 二代测序（next-generation sequencing, NGS）被用于检测这14 个常见的突变基因。30 名术前RCC 患者中有20 名在所有检测基因中均具有可检出基因改变。即使是早期疾病且肿瘤大小仅为1.1×0.7×0.5 cm3的患者，也可检测到ctDNA 突变。这表明即使在局限性RCC 中低肿瘤负担的患者也可定量检测到ctDNA。

另一项研究使用实时定量PCR 来检测92 例不同阶段的透明细胞RCC 患者的ctDNA 水平[24]。研究者发现，mRCC 患者的ctDNA 高于局限性RCC（6.04 vs 5.29，P=0.017）。研究还表明，RCC 的复发具有较高的ctDNA 水平（P=0.024）。这些研究结果表明，可按设定的时间间隔定期监测ctDNA，以监测疾病的复发情况。ctDNA 的使用可减少与筛查CT 扫描相关的潜在危害，包括造影剂肾病和放射线照射。

在局限性RCC 中，少数研究已报道了ctDNA 在疾病监测中的新用途。Hauser 等[25]研究发现，与健康患者相比，RCC 中ctDNA 的CPG 岛超甲基化很常见，并且可作为RCC 初始诊断的潜在生物标志物。在另一项研究中，研究人员分析了整个RCC 各阶段的基因组和线粒体ctDNA 浓度。他们使用基因组和线粒体ctDNA 的组合，为RCC 开发了新的诊断和预后模型[26]。当然，这两种使用ctDNA 的新技术都需在更大的队列中进行进一步验证，以更清楚地描述其临床用途。

4 ctDNA 在转移性肾细胞癌中的应用

4.1 转移性肾癌中ctDNA 的突变

对于mRCC，临床实践中常规使用靶向疗法，如VEGF 酪氨酸激酶抑制剂或mTOR 抑制剂，但尚没有预测性的生物标志物指导这些靶向疗法的选择。随着液体活检技术的发展，mRCC 中的ctDNA 可作为免疫治疗反应的生物标记物。一项对220 名mRCC患者的大型研究首次评估了mRCC 中ctDNA 的突变情况[14]。在该研究中，检测了ctDNA 中的基因改变。在评估的220 名患者中，在78.6%的患者中至少检测到一种基因改变，表明mRCC 脱落了可检测量的ctDNA。在ctDNA 中检测到最常见的基因改变是TP53（35%）、VHL（23%）、EGFR（17%）、NF1（16%）和ARID1A（12%）。与之前TCGA 中组织NGS 检测的RCC 研究对照相比，此研究RCC 中检测到的基因改变的情况相似；但是，两项研究之间基因改变的频率有所不同。如，在TCGA 研究中，ctDNA 队列中只有不到3%的患者有TP53 改变，而此研究ctDNA队列中有35%的患者有TP53 改变[27]。肿瘤组织和ctDNA 的NGS 研究之间的基因改变频率差异可能是由于患者人群的差异（即局限性与转移）所致。这项研究表明ctDNA 的NGS 可提供mRCC 中存在的突变的特征。

由于ctDNA NGS 能够检测多线治疗后的变化情况，因此ctDNA 可用于符合生物标志物指导临床试验条件的患者。生物标记物指导的临床试验已在mRCC 中使用，并且有望应用更加普遍。如，MET 的改变在1 型乳头状RCC 中很常见[20]。在沃利替尼用于pRCC 的Ⅱ期临床试验中，MET 引起的乳头状RCC 对治疗表现出强烈的反应，而非MET 引起的乳头状 RCC 缺没有反应（P=0.002）[28]，因此 ctDNA 可用于此生物标记物指导的临床试验中。

肿瘤组织和ctDNA NGS 检测到的基因改变的比较来自于对19 例mRCC 患者的研究[29]。当分析两个测试中检测到的基因改变时，组织和ctDNA 之间检测到的基因改变的中位数相似（中位数3.0 vs 1.0，P=0.14）；但是，两个测试之间的一致性比率仅为8.6%。该研究的临床实用性受到组织与ctDNA NGS 之间检测时间的限制。在其他恶性肿瘤的研究中，研究者控制了两次检查之间的时间，结果所报告的一致率更高[30]。然而，ctDNA 和组织NGS 之间的显著不一致也可能反映了患者体内肿瘤的异质性。2012年，对4 名mRCC 患者的研究中，同一患者多个部位的活检显示体细胞改变具有明显的空间异质性[31]。ctDNA 可能比组织的NGS 更准确地反映了患者体内肿瘤的异质性，并且可能更准确地识别了突变。这将使ctDNA 成为鉴定有新的转移的理想测试。

4.2 ctDNA 与影像学

在大多数临床情况下，每3 个月使用CT 监测mRCC 患者的胸部/腹部/骨盆。反复进行CT 扫描既耗时、成本高昂，又使癌症患者遭受高剂量的辐射。ctDNA 有潜力替代mRCC 中的这些检查。在最近的一项针对34 例mRCC 患者的研究中，可检测到ctDNA 的患者比未检测到ctDNA 的患者具有更高的影像学负担（P=0.01）[32]。尽管这些发现表明ctDNA具有补充或替代mRCC 患者频繁进行CT 扫描的能力，但这些结果来自一项小型回顾性研究，尚需在较大的人群中进行进一步评估。

4.3 ctDNA 与肿瘤突变负荷

纳武单抗（Nivolumab）是针对PD-1 的单克隆抗体，目前已批准用于mRCC 的挽救性治疗[33]。预计更多的免疫检查点抑制剂将在不久的将来获得治疗mRCC 的批准。最近的研究显示，与单独使用舒尼替尼进行mRCC 的一线治疗相比，纳武单抗加伊匹单抗（ipilimumab）的组合改善了总生存期（OS）[34]。而且，一线研究中正在研究免疫检查点抑制剂和靶向治疗的许多组合。临床上并没有使用可预测对免疫检查点抑制剂有较好应答的生物标志物，但它们可帮助mRCC 等恶性肿瘤制定个性化的治疗顺序。ctDNA 已显示出作为免疫检查点抑制剂的预测生物标记物的潜力。

纳武单抗最近被批准用于治疗任何具有错配修复缺陷的癌症[35]。具有错配修复缺陷的肿瘤具有异常高的肿瘤突变负荷。最近的一项研究表明，ctDNA 可以替代肿瘤突变负荷[36]。在对69 名患者的实体瘤研究中，包括3 名mRCC 的患者，均接受了免疫检查点抑制剂（定义为≥6 个基因改变ctDNA）治疗。预测客观缓解率（40.9%vs 15.9%，P=0.025）和无进展生存（2.85 vs 2.19 m，HR=0.59，P=0.025）改善。这些结果清楚地表明，ctDNA 中更多的基因改变可替代高肿瘤突变负荷，并且可预测对免疫检查点抑制剂的反应。

有一项独特的病例报告证明了ctDNA 作为mRCC对免疫疗法反应的预测性生物标志物的价值[37]。一名44 岁的男子被诊断出患有mRCC，他的脑部发生孤立性转移。依次用大剂量白介素-2、帕唑帕尼、贝伐单抗、尼古鲁单抗加依匹莫单抗和卡博替尼治疗。卡博替尼治疗后，评估了ctDNA NGS 并显示出大量的基因改变；而后又使用了纳武单抗，之后的ctDNA NGS 没有可检测到的基因改变。这个案例说明了ctDNA 在mRCC 治疗中的两个潜在作用：第一，与先前讨论的研究一致，ctDNA 中的大量基因改变可替代高肿瘤突变负荷，并预测对免疫疗法的反应；第二，开始治疗后在ctDNA 中检测到的基因改变数量可能反映了治疗反应。这种观察尚需在更大的队列中进一步验证。

5 新技术

尽管液体活检在临床上日益受到重视，但由于目前ctDNA 检测方法的局限性，某些设置（如癌症筛查）无法从这种无创技术中受益。尤其是ccfDNA和ctDNA 之间的区别需要一种高度敏感的技术。为此，加拿大的一个小组开发了一种新的基于免疫沉淀的方案，以分析少量ccfDNA 的甲基化。他们发现，通过低成本、高效率的方法，可检测癌症特异性差异甲基化区域（DMR），从而可提高ctDNA 检测的灵敏度[38]。

6 结语与展望

液体活检在临床中的应用为新的研究领域铺平了道路。目前虽然可以使用组织和ctDNA 进行预测性标志物的鉴定、预后和分子亚型的分类，但随时间推移追踪克隆的改变，及早发现耐药机制，监测治疗反应，检测复发却仅能以无创方式的液体活检才有可能。

目前正在研究实施液体活检的许多问题和挑战，以及新兴的液体活检分析物（如细胞外囊泡、循环无细胞RNA、支链氨基酸、蛋白质、肿瘤相关的血小板），采用开发综合的多维分析方法对于解决这些挑战至关重要。

ctDNA 的NGS 检测是一项新颖的技术，它有可能通过提供肿瘤突变情况来改变临床实践。在局限性RCC 中，ctDNA 有潜力作为肾切除术后疾病复发的筛查工具。在mRCC 中，ctDNA 有望作为对免疫治疗反应的预测性生物标志物。此外，ctDNA 可为全身性治疗后的评估提供支持。在RCC 的所有阶段中，液体活检对患者都具吸引力，因为它们均属无创检查，且可连续重复进行而不会对患者造成重大伤害。目前，已经有越来越多ctDNA 的相关研究应用于临床试验[39-42]，而随着技术的不断革新，更加准确且稳定的检测方法将被不断的开发出来，并进入临床试验验证。相信未来，ctDNA 有可能影响肾细胞癌的诊断和治疗，其临床应用前景将更加广阔。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突