头花蓼内生真菌Diaporthe sp.代谢产物中的抗菌活性成分研究*

徐国波, 王栋, 朱勤凤, 刘香, 廖尚高**

(1.贵州医科大学 药学院， 贵州 贵阳 550025； 2.教育部民族药与中药开发应用工程研究中心， 贵州 贵阳 550004)

头花蓼(Polygonumcapitatum)为蓼科(Polygonaceae)蓼属(Polygonum)植物，是贵州省少数民族地区常用的苗药，临床上主要用于治疗泌尿系统感染疾病[1-2]。植物内生菌代谢产物因与宿主代谢产物的结构相关或功效相近，已成为寻找活性分子的重要资源[3-4]。前期课题组发现头花蓼内生菌代谢物对大肠杆菌、金黄色葡萄球、表皮葡萄球菌、铜绿假单孢菌等尿路感染菌具有抗菌活性[5-6]，认为Diaporthesp.是头花蓼植物中具有抗菌作用的内生菌，但其抗菌物质不明确，本文对Diaporthesp.代谢产物进行分离纯化，最后对单体化合物进行药效评估，以期从中发现具有抗菌活性的天然产物。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1仪器 JEOL ECX 400 核磁共振波谱仪(日本电子株式会社JEOL)，Bruker Avance 600核磁共振波谱仪(德国Bruker公司)，TSQ Endura三重四级杆质谱仪(赛默飞世尔科技公司)，高压灭菌锅(上海申安医疗器械厂)，超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)，LC3000制备型高效液相色谱仪(北京创新通恒科技)，OSB-2100 旋转蒸发仪(日本 EYELA，东京理化器械株式会社)。

1.1.2试剂 薄层层析硅胶G254、柱层析硅胶(200～300目、300～400目)(青岛海洋化工厂)，Sephadex LH-20(瑞士Pharmacia Biotech 公司)，环丙沙星(纯度99%，北京索莱宝公司)，石油醚(60～90 ℃)、乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷、DMSO、甲醇、冰乙酸均为分析纯。

1.1.3菌种 实验菌株为从贵州省道地药材头花蓼的茎中分离得到的内生真菌，经rDNA的ITS序列相似性鉴定为Diaporthesp.。

1.2 方法

1.2.1发酵培养 将Diaporthesp.菌株活化培养后，接种至大米固体培养基中，28 ℃下恒温培养 30 d。

1.2.2提取与分离 取真菌固态大米发酵物10.0 kg，室温下用乙酸乙酯浸提3次，减压浓缩得浸膏158.1 g。总浸膏经硅胶柱层析(石油醚 ∶丙酮，1 ∶0、10 ∶1、5 ∶1、3 ∶1、2 ∶1、1 ∶1、1 ∶0)梯度洗脱得7个组分：Fr1(49.0 g)、Fr2(64.3 g)、Fr3(7.2 g)、Fr4(6.4 g)、Fr5(5.5 g)、Fr6(15.6 g)和Fr7(10.1 g)，其中Fr1和Fr2主要为油脂类和麦角甾醇类物质。Fr3经过正相(石油醚 ∶丙酮，5 ∶1)洗脱得到5个组分(Fr3-1～Fr3-5)，Fr3-3和Fr3-4分别经过Sephadex LH-20(甲醇)洗脱得到化合物10(10 mg)和化合物11(13 mg)；Fr4经过正相(石油醚 ∶乙酸乙酯，10 ∶1)洗脱得到7个组分(Fr4-1～Fr4-7)，其中Fr4-2经过正相(氯仿 ∶丙酮，30 ∶1)洗脱得到化合物4(17 mg)，Fr4-4经过Sephadex LH-20(氯仿 ∶甲醇，3 ∶2)得到化合物6(5 mg)，Fr4-5经过正相(石油醚 ∶乙酸乙酯，5 ∶1)和Sephadex LH-20(甲醇)洗脱得到化合物7(7 mg)和8(8 mg)；Fr-5经过Sephadex LH-20(甲醇)和HPLC(20%甲醇-水)得到化合物5(4 mg)和9(5 mg)；Fr-6经过Sephadex LH-20(甲醇)洗脱再经过HPLC(10%甲醇-水)得到化合物1(10 mg)和化合物2(11 mg)；Fr-7经过正相(氯仿 ∶甲醇，20 ∶1)洗脱，再经过HPLC(10%甲醇-水)得到化合物3(7 mg)。

1.2.3抗菌活性测定 参考文献[6-7]的方法，采用96孔板法分别检测各化合物对大肠杆菌(EscherichiacoliATCC25922)和金黄色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC25923)的最低抑菌浓度(MIC)。将复苏后的细菌接种至MH(B)培养基中，于37 ℃培养箱中培养18 h，然后采用麦氏比浊法稀释细菌浓度至(5～10)×108CFU/L备用。采用5%的DMSO无菌水溶液将各化合物溶解配置成512 mg/L的母液，用无菌蒸馏水稀释至所需浓度。实验中以环丙沙星作为阳性药，5% DMSO无菌水溶液作为阴性对照。加样后在37 ℃下培养18 h，最后加入终浓度为0.25% TTC作为微生物生长指标，继续培养3 h，读取化合物的MIC值。实验重复3次。

2 结果

2.1 化合物结构鉴定

2.1.1化合物1白色粉末，1H-NMR (CD3OD, 400 MHz)δ: 7.82 (1H, d,J= 1.1 Hz, H-6), 6.28 (1H, t,J= 6.9 Hz, H-1′), 4.39 (1H, m, H-3′), 3.90 (1H, m, H-4′), 3.75 (2H, m, H-5′), 2.22 (2H, m, H-2′), 1.88 (3H, brs, 5-CH3)。13C-NMR (CD3OD, 100 MHz)δ: 166.6 (C-2), 152.6 (C-4), 138.3 (C-6), 111.7 (C-5), 88.9 (C-4′), 86.4 (C-1′), 72.7 (C-3′), 62.9 (C-5′), 41.3 (C-2′), 12.6 (5-Me)。ESI-MSm/z: 243.0 [M+H]+。以上数据与文献[8]报道的胸腺嘧啶核苷(thymidine)波谱数据基本一致。

2.1.2化合物2白色粉末，1H-NMR (CD3OD, 400 MHz)δ： 8.05 (1H, d,J= 8.2 Hz, H-6), 5.91 (1H, d,J= 3.7 Hz, H-1′), 5.65(1H, d,J= 8.2 Hz, H-5), 4.20 (1H, m, H-3′), 3.94 (1H, m, H-4′), 3.82 (2H, m, H-5′), 3.70 (1H, dd,J= 12.0 Hz, 4.0 Hz, H-2′), 3.48 (3H, s, -OCH3)。13C-NMR (CD3OD, 100 MHz)δ： 166.5 (C-4), 152.4 (C-2), 142.6 (C-6), 102.6 (C-5), 88.9 (C-1′), 86.2 (C-4′), 85.1 (C-2′), 69.9 (C-3′), 61.7 (C-5′), 58.9 (2′-OCH3)。ESI-MSm/z: 257.0 [M-H]-。以上数据与文献[9]报道的2′-O-甲氧基尿嘧啶核苷(2′-O-methyluridine)波谱数据基本一致。

2.1.3化合物3白色粉末，1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz)δ： 7.87 (1H, d,J=8.2 Hz, H-6), 5.77 (1H, d,J= 6.0 Hz, H-1′), 5.63 (1H, d,J= 8.2 Hz, H-5), 4.02 (1H, d,J= 5.0 Hz, H-2), 3.95 (1H, d,J= 3.5 Hz, H-3′), 3.83 (1H, dd,J= 3.5 Hz, H-4′), 3.60 (1H,d,J= 12.0 Hz, H-5′a), 3.52 (1H, d,J= 12.0 Hz, H-5′b)。13C-NMR (DMSO-d6,100 MHz)δ：150.9 (C-2), 163.4 (C-4), 101.9(C-5), 140.9 (C-6), 87.9 (C-1′), 70.0 (C-2′), 73.7(C-3′), 84.9 (C-4′), 60.9(C-5′)。ESI-MSm/z： 243.0 [M-H]-。以上数据与已知文献[10]报道的尿嘧啶核苷(uridine)波谱数据基本一致。

2.1.4化合物4白色固体，1H-NMR (DMSO-d6, 600 MHz)δ：9.79 (1H, s, -CHO), 7.75 (2H, d,J= 8.5 Hz, H-2, 6), 6.92 (2H, d,J= 8.5 Hz, H-3, 5)。13C-NMR (DMSO-d6, 150 MHz)δ：115.82 (C-3, 5), 128.42 (C-1), 132.09 (C-2, 6), 163.30 (C-4), 190.95 (-CHO)。ESI-MSm/z：121.0 [M-H]-。以上数据与已知文献[11]报道的对羟基苯甲醛(4-hydroxybenzaldehyde)波谱数据基本一致。

2.1.5化合物5无色油状，1H-NMR (CD3OD, 600 MHz)δ： 11.76 (1H, s, OH-C3),7.23 (1H, d,J= 2.1 Hz, H-6), 6.70 (1H, d,J= 2.1 Hz, H-5′), 6.63 (1H, d,J= 2.1 Hz, H-3′), 6.35 (1H, d,J= 2.1 Hz, H-4), 2.69 (3H, s, H-7′)。13C-NMR (CD3OD, 150 MHz)δ：25.3 (C-7′), 97.2 (C-2), 100.9 (C-4), 101.6 (C-3′), 104.5 (C-6), 108.9 (C-1′), 117.6(C-5′), 138.1(C-1), 152.7(C-2′), 158.5(C-4′), 164.1(C-7), 164.8(C-5), 165.9(C-3)。ESI-MSm/z：256.9 [M-H]-。以上数据与已知文献[12]报道的alternariol波谱数据基本一致。

2.1.6化合物6无色油状，1H-NMR (CD3OD, 600 MHz)δ：7.54 (1H, dd,J= 7.5, 8.4 Hz, H-7), 7.05 (1H, d,J= 7.5 Hz, H-8), 6.90 (1H, dd,J= 8.4, 0.8 Hz, H-6), 4.52 (2H, m, H-2, H-3), 1.43 (3H, d,J= 6.3 Hz, CH3-2)。13C-NMR (CD3OD, 150 MHz)δ：170.4 (C-4), 163.0 (C-5), 144.3 (C-8a), 137.9 (C-7), 117.9 (C-6), 108.2 (C-4a), 81.8 (C-2), 69.6 (C-3), 18.3 (C-2a)。ESI-MSm/z: 193.0 [M-H]-。以上数据与已知文献[13]报道的2-甲基-3,5-羟基色酮波谱数据基本一致。

2.1.7化合物7黄色固体，1H-NMR (CD3OD, 600 MHz)δ： 7.41 (1H, d,J= 7.5 Hz, H-6), 5.60 (1H, d,J= 7.5 Hz, H-5)。13C-NMR (CD3OD, 150 MHz)δ: 167.5 (C-1), 143.7 (C-5), 101.9 (C-6)。ESI-MSm/z：111.2 [M-H]-。以上数据与已知文献[13]报道的尿嘧啶(uracil)波谱数据基本一致。

2.1.8化合物8白色固体，1H-NMR (CD3OD, 600 MHz)δ：1.35 (3H, d,J= 6.2 Hz, H-9), 2.81 (2H, m, H-4), 3.78 (3H, s, H-10), 4.46 (1H, m, H-3), 6.79 (1H, d,J= 7.6 Hz, H-5), 6.95 (1H, d,J= 8.5, H-7), 7.42 (1H, dd,J= 8.5, 7.6 Hz, H-6)。13C-NMR (CD3OD, 150 MHz)δ：20.9 (C-9), 36.7 (C-4), 56.5 (C-10), 76.3 (C-3), 112.3 (C-7), 114.2 (C-8a), 120.7(C-5), 136.5 (C-6), 143.9 (C-4a), 162.7 (C-8), 165.6 (C-1)。ESI-MSm/z： 193.1 [M+H]+。以上数据与已知文献[14]报道的(-)-(3R)-mellein methyl ether波谱数据基本一致。

2.1.9化合物9白色粉末，1H-NMR (CD3OD, 400 MHz)δ： 6.32 (1H, s, H-4), 6.26 (2H, brs, H-5, H-7), 4.17 (1H, m, H-2′), 3.97 (1H, m, H-4′), 2.59 (1H, dd,J= 14.5, 4.9Hz, H-1′), 2.54 (1H, dd,J= 14.5, 8.0 Hz, H-1′), 1.54 (2H, m, H2-3′), 1.15 (3H, d,J= 6.0 Hz, CH3-5′)。13C-NMR (CD3OD, 100 MHz) δ：24.53 (C-5′), 43.11 (C-1′), 47.13 (C-3′), 65.32 (C-4′), 67.12 (C-2′), 100.00 (C-9), 102.7 (C-7), 103.8 (C-5), 107.3 (C-4), 141.4 (C-10), 156.3 (C-3), 164.9 (C-8), 167.4(C-6), 168.0 (C-1)。ESI-MSm/z：279.1 [M-H]-。以上数据与已知文献[15]报道的3-(2R,4S-dihydroxypentyl)-6,8-dihydroxyisocoumarin波谱数据基本一致。

2.1.10化合物10黄色油状，1H-NMR (Acetone-d6, 400 MHz)δ： 7.03 (2H, d,J= 8.4 Hz, H-2′, H-6′), 6.71 (2H, d,J= 8.4 Hz, H-3′, H-5′), 4.13 (2H, t,J= 7.1 Hz, H2-1), 2.78 (2H, t,J= 7.1 Hz, H2-2), 1.92 (3H, s, Me)。13C-NMR (Acetone-d6, 100 MHz)δ： 20.9 (Me), 34.8 (C-2), 65.8 (C-1), 116.2 (C-3′,4′), 129.6 (C-1′), 130.8 (C-2′,6′), 156.8 (C-4′), 171.3 (C=O)。ESI-MSm/z： 179.1 [M-H]-。以上数据与已知文献[16]报道的 2-(4-hydroxyphenyl)ethylacetate波谱数据基本一致。

2.1.11化合物11白色片状晶体，1H-NMR (CD3OD, 400 MHz)δ： 7.01 (2H, d,J= 8.6 Hz, H-4, H-8), 6.73 (2H, d,J= 8.6 Hz, H-5, H-7), 3.69 (2H, t,J= 7.1 Hz, H2-1), 2.71 (2H, t,J= 7.1 Hz, H2-2)。13C-NMR (CD3OD, 100 MHz)δ: 39.5 (C-2), 64.7 (C-1), 116.3 (C-5, C-7), 131.0 (C-4, C-8), 131.2 (C-3), 156.7 (C-6)。ESI-MSm/z：139.0 [M+H]+。以上数据与已知文献[17]报道的对羟基苯乙醇[4-(2-hydroxyethyl)phenol]波谱数据基本一致。

2.2 抗菌活性

对已分离得到的11个化合物分别采用96孔板二倍稀释法对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌进行抗菌活性测试，结果显示，化合物5对大肠杆菌MIC为16 mg/L，对金黄色葡萄球菌MIC为32 mg/L；化合物6、8、9仅对大肠杆菌具有抑制作用，MIC均为32 mg/L(阳性药环丙沙星对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC均为4 mg/L)。其余化合物的MIC均>32 mg/L。

3 讨论

头花蓼属于蓼科蓼属多年生草本植物，是贵州省地道药材，临床上主要用于泌尿系统感染[18]。现代研究表明，头花蓼及其制剂对大肠杆菌、金黄色葡萄球、淋球菌、幽门螺旋杆菌以及多重耐药菌等具有非常突出的抗菌活性[19-23]。鉴于植物内生菌直接参与宿主次生代谢产物的合成、转化，诱导宿主次生代谢产物的形成[24-25]，内生菌本身也能产生丰富的活性次生代谢产物[26-27]，因此头花蓼内生菌次生代谢物可能是寻找抗菌活性小分子的重要资源。

Diaporthe属真菌为植物中广泛存在的内生菌[28]，前期筛选发现，从头花蓼中获得的内生菌Diaporthesp.与头花蓼一样，也具有较好的抗菌作用。本研究从该内生真菌中分离得到11个代谢产物，其中7个化合物(1～3或7～10)为Diaporthe属的首次报道。进一步的抗菌活性测试证实，其中的4个化合物(5、6、8、9)具有显著的抗菌活性，是Diaporthesp.内生菌的抗菌活性物质。这些发现不仅丰富了真菌Diaporthe属的化合物库，说明具有抗菌作用的苗药头花蓼中的内生菌也能产生抗菌活性物质，为苗药头花蓼内生真菌的开发应用奠定了基础。