肿瘤浸润淋巴细胞与结直肠癌预后关系的研究进展

龙美玲, 陈倩文, 刘璐, 谢菲岚, 刘锦涛△

1广东医科大学研究生学院(广东湛江 524000)； 2 广东医科大学深圳宝安临床医学院、深圳市宝安区人民医院消化内科(广东深圳 518100)

结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，2018年全国恶性肿瘤统计发现其发病率居恶性肿瘤发病谱的第3位，仅次于肺癌和胃癌；病死率居第2位，居肺癌之后[1]。目前，TNM分期是临床上制订CRC治疗方案的主要依据，按照指南，TNM分期Ⅰ期和低危Ⅱ期患者术后无需接受辅助治疗就可以达到理论上的完全治愈，并长期存活。然而，仍有约10%的Ⅰ期和20%的Ⅱ期患者术后会发生复发转移[2]。临床上亟需其他预测预后的辅助指标来更精确分期，并为术后辅助治疗提供更多的依据，因此寻找更准确的CRC预后预测指标已成为热点问题，其中肿瘤浸润淋巴细胞 (tumor infiltrating lymphocyte, TIL)是目前关注的重点。2006年Galon等[3]发表的文献首次成功描述了TIL的不同亚群可预测CRC患者的预后，随后越来越多的研究发现，TIL与CRC预后以及局部晚期直肠癌新辅助放疗后肿瘤消退程度密切相关[4]。现将TIL与CRC预后关系的研究进展进行综述。

1 TIL的组成及作用机制

TIL是一群存在于肿瘤及其间质内，以淋巴细胞为主的异质性免疫细胞，包括T细胞、B细胞、树突状细胞(DC)及自然杀伤细胞(NK)等。根据免疫细胞的浸润情况，肿瘤可分为“热肿瘤(T淋巴细胞浸润)”和“冷肿瘤(无T淋巴细胞浸润)”。在“热肿瘤”中，趋化因子促进CD8+效应T细胞进入肿瘤内，但它们的功能被程序性细胞死亡蛋白配体-1(PD-L1)、吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)和调节性T细胞(regulatory T cells， Tregs)等负向调控。对于“冷肿瘤”，低炎症环境、趋化因子匮乏、肿瘤间质致密以及肿瘤新生血管异常等因素都会影响T细胞往肿瘤区域的迁移[5]。

免疫编辑理论认为，免疫系统不仅具有清除肿瘤细胞的能力，也能促进肿瘤的生长。在这个过程中，免疫细胞扮演了双重角色，一方面NK细胞和细胞毒性T细胞(cytotoxic T cell, CTL)直接识别和清除部分肿瘤细胞，从而抑制肿瘤生长；另一方面，在肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)中，不断富集的免疫抑制性细胞，如肿瘤相关的巨噬细胞(tumor-associated macrophage，TAM)、Tregs、髓源性抑制细胞和免疫抑制因子转化生长因子-β(TGF-β)、白细胞介素-10(IL-10)、前列腺素等不仅能抑制正常的抗肿瘤免疫反应，而且能对肿瘤细胞的特性进行“重塑”，使其恶性程度更高和抵抗免疫攻击能力更强[6]。TIL位于瘤内或其间质，是肿瘤免疫反应的主要参与者，其亚群种类繁多，且不同亚群在肿瘤发生发展中的作用差异极大，对肿瘤预后的影响也不尽相同。

2 TIL与CRC预后的关系

2.1 肿瘤浸润T细胞与CRC预后的关系

2.1.1 CD4+辅助性T淋巴细胞 CD4+T细胞是适应性免疫的主要组成成分，但在肿瘤免疫中的作用仍不明确，其可能的原因是CD4+T细胞具有不同的细胞亚群，且不同亚群之间功能差异极大。CD4+T细胞可分为辅助性T细胞(包括Th1、Th2、Th17和Tfh)和Tregs。Th1细胞分泌细胞因子白细胞介素-2(IL-2)和γ干扰素(IFN-γ)协同刺激CTL的增殖和分化以及增强NK细胞的杀伤能力。Th2细胞分泌细胞因子如IL-4、IL-5、IL-6、IL-10及IL-13等促进促进B细胞增殖、分化和抗体形成，从而促进体液免疫应答，同时可抑制Th1增殖。正常机体环境下Th1细胞与Th2细胞保持着动态平衡，当在癌症和其他疾病时两者平衡将会打破，且癌症患者血液和肿瘤组织中Th2细胞的数量往往会大于Th1细胞。王静等[7]采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测40例不同分期CRC组织，发现CRC组织中Th1细胞因子(IL-2、IFN-γ)在癌组织中的表达量较周围正常组织中的表达量低，而Th2细胞因子的表达量则相反，该发现表明，CRC改变了Th1和 Th2的平衡，使其往Th2方向发展。研究还发现Th2/Th1与CRC的Duke′s 分期相关，作者认为Th2类的细胞因子能够抑制肿瘤免疫，使肿瘤发生免疫逃逸。

Th17细胞通过分泌IL-17、TNF-α等细胞因子，参与固有免疫和某些炎症的发生，目前研究虽然已发现Th17细胞及其分泌的细胞因子与多种肿瘤的发生和发展存在密切关系，但在CRC中起抗瘤还是促瘤作用还没确定，以及其作用机制尚未完全明确。在CRC初期，Th17细胞可能发挥促炎性反应的作用，抑制肿瘤的生长，但随着癌症的发展，机体免疫系统失衡，Th17细胞发挥促肿瘤或抑制抗肿瘤效应的作用。Tosolini等[8]发现CRC中高表达Th17细胞特征性基因(RORC、IL-17A)的患者预后不良，而具有高表达Th1细胞特征基因(Tbet、IRF1、IL12Rb2、STAT4)的患者可延长无病生存期(disease-free survival，DFS)，而Th2特征基因(IL-4、IL-5、IL-13)表达情况与预后无明显相关性。此外，作者还发现联合分析Th1和Th17特征基因表达水平，能够预测患者复发情况。近年较多研究发现，IL-17在恶性肿瘤进程中具有双重作用，一方面，IL-17可以通过上调肿瘤细胞的血管内皮生长因子促进肿瘤内部血管生成，表达MMP-2和MMP-7促进肿瘤细胞浸润和转移，另一方面可通过募集T淋巴细胞浸润、增强NK细胞和CTL的活性，促进中性粒细胞浸润等抑制肿瘤的发展。Liu等[9]研究发现CRC患者的肿瘤区域中IL-17的水平较非肿瘤区域高，并且证实巨噬细胞和Th17细胞表达的IL-17与高微血管密度和较差存活率相关，单变量和多变量分析显示IL-17是总生存期(overall survival，OS)的独立预后因素，此外，该研究还发现IL-17诱导CRC中癌细胞产生血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)促进形成肿瘤血管。Yoshida等[10]使用组织芯片研究199例CRC，发现Th17(RORγT/CD3)比率与患者淋巴结转移呈正相关；同时，多因素分析表明，Th17(RORγT/CD3)比率是患者OS的独立预测因素。

2.1.2 调节T淋巴细胞 Tregs是T淋巴细胞一个亚型，起免疫抑制调节作用。根据 Tregs的起源、抗原特异性的不同，将其分为自然调节性 T 细胞(naturally occurring regulatory T cells，nTregs)和诱导产生的适应性调节(induced regulatory T cells, iTregs)，nTregs 细胞来源于胸腺，表型为CD4+CD25+，是Tregs细胞的主要成分，CD4+CD25highFOXP3+自然(n)Tregs通常负责维持外周血耐受以控制癌症相关的炎症[11]。FOXP3 (forkhead box p3)是一种转录因子，是Tregs最特异的标志，并参与Tregs的分化和功能。Tregs通过直接接触抑制靶细胞活化负调控免疫应答或分泌TGF-β、IL-10等细胞因子抑制免疫应答。在大多数人类癌症中如卵巢癌、胰腺癌、肝细胞癌，FOXP3+Tregs的高密度浸润与肿瘤生长和预后不良有关[12]。但是在CRC的一些研究发现肿瘤中Tregs的浸润与良好的预后相关[13-14]，可能是由于Tregs在CRC的早期阶段抑制炎症反应而限制肿瘤发生。然而，一些研究表明，CRC组织中的Tregs可能通过抑制抗肿瘤免疫反应而有助于疾病进展[15]。这些看似矛盾的结果表明存在功能不同的具有不同免疫抑制水平的Tregs亚群[16]。Gai等[17]研究发现，高密度的Tregs与CRC患者TNM分期以及不良预后相关，但是Tregs浸润在患者年龄、肿瘤大小、组织学、侵袭深度和肿瘤分化等方面差异无统计学意义。Vald等[18]通过免疫组化评估42例CRC组织中CD3+T细胞和FOXP3+Tregs密度，发现两者密度与存活率呈正相关，但是只有FOXP3+Tregs是一个独立预后因素。Hanke等[19]分析Ⅱ期结直肠癌标本，结果显示肿瘤内CD8+T和CD3+T的密度与肿瘤周围淋巴细胞的存在显著相关，FOXP3+Tregs密度与患者性别、年龄、肿瘤分级、肿瘤分期、肿瘤定位、肿瘤组织学类型、肿瘤边缘浸润类型、肿瘤周围淋巴细胞浸润或淋巴血管侵犯发生之间无相关性，多因素分析显示在肿瘤内高密度FOXP3+Tregs、低肿瘤分期和无淋巴血管侵犯是Ⅱ期淋巴结阴性的CRC的独立良好预后因子，并认为FOXP3+Tregs免疫标记、肿瘤分期评估和淋巴血管侵犯可能有助于确定具有潜在攻击行为的Ⅱ期癌症和可能受益于辅助治疗的CRC患者，研究还发现右侧CRC内的CD8+和FOXP3+Tregs密度比左侧CRC更高。然而Loddenkemper等[20]研究在40例CRC患者中原位分析FOXP3+Tregs浸润，发现肿瘤中的Tregs浸润明显高于健康结直肠，CRC基质中的Tregs浸润显著高于上皮中的Tregs浸润，并发现具有Tregs高浸润的患者与具有Tregs低浸润的患者在存活率上没有差异,没有差异的原因可能是评估Tregs浸润和存活之间的相互作用需要阶段校正分析。

2.1.3 记忆T淋巴细胞 记忆T细胞通常被分为中央记忆细胞(central memory T lymphocyte，TCM)和效应记忆细胞(effector memory T lymphocyte，TEM)，TCM在血液和次级淋巴器官如淋巴结之间循环，维持记忆反应，不执行快速效应功能；TEM可以从血液迁移到非淋巴组织如肿瘤组织，可执行快速效应功能[21]。除了部分CD8+TEM表达CD45RA+，其他的TNM几乎都表达CD45RO+，因此CD45RO+是TNM最好的标志物[22]。在目前的研究，CD45RO+T淋巴细胞在CRC癌巢和癌旁的高度浸润都与患者预后良好及减少潜在转移相关。有研究认为，CRC组织CD45RO+的浸润淋巴细胞密度与CRC患者的更长存活期相关，可以作为CRC预后的独立指标[23-24]。Galon等[3]和Pagès等[25]通过使用大规模实时聚合酶链反应和组织微阵列方法，使用数字化高分辨图像分析系统客观和定量评估CD45RO+细胞以限制观察者偏倚，证实了CRC中CD45RO+T细胞高密度浸润可提高DFS，证明了CD45RO+T细胞的持久抗肿瘤能力在控制疾病复发中发挥重要作用。但是Pagès等[25]研究表明将CD8+T细胞和CD45RO+T细胞结合起来预测CRC患者预后时，因两者会有重叠，可能会诱发选择性偏倚。Pagès等[26]进行深入研究发现CD45RO+T细胞高密度浸润与CRC早期转移性侵袭如血管栓塞、淋巴管侵犯和神经周围侵袭的缺乏有关。Lee等[27]研究证实了FOXP3+Tregs和CD45RO+T细胞对生存具有独立的预后意义，可能有助于改善早期结肠癌的预后。Nosho等[23]研究与Lee的研究一致，并且证明CRC患者中CD45RO+T细胞密度的预后能力大于CD3+T细胞、CD8+T细胞、FOXP3+Tregs。

2.1.4 CD8+细胞毒性T细胞 CD8表达于30%～35%T淋巴细胞表面，通常所称的CD8+T淋巴细胞指的是CTL，它们特异性识别内源性抗原肽-组织相容性复合体(MHC)Ⅰ类分子复合物，进而连续杀伤多个靶细胞(肿瘤细胞或细胞内被感染的细胞)，而不影响正常细胞，且杀伤靶细胞过程中自身不受伤害。CD8+T细胞的细胞毒性作用是机体抗肿瘤免疫的重要机制，目前大量研究显示CD8+T细胞与CRC[3, 25]、肺癌[28]、食管癌[29]、卵巢癌[30]、肾细胞癌[31]、胰腺癌[32]的良性预后相关。Ling等[33]研究发现CRC肿瘤上皮中的CD8+T细胞的浸润提供了最强的预后信息，而在肿瘤边缘和肿瘤中心，FOXP3的表达与预后的关联最强。有研究建立了“免疫分数”的评估方法，分析TIL细胞类型、密度以及位置与临床结果之间关系，发现无论局部肿瘤的进展或淋巴结受累程度，CD3+T细胞、CD8+T淋巴细胞和记忆性CD45RO+T细胞与良好预后相关[3, 25, 34-35]。他们认为“免疫分数”方法比常规的TNM分期更能精确预测患者的预后[36]。Hu等[37]为进一步评估CD8+T在CRC中的预后意义，对CD103和CD8进行双重染色来代表CRC组织中的CD8+T细胞，发现CD8+T细胞高密度浸润或CD103+CD8+T细胞高密度浸润的OS较高，并且CD8+T细胞高密度浸润与晚期TNM分期呈显著负相关，CD103+CD8+T细胞高密度浸润与远处转移呈显著负相关。然而以上的研究较少研究TIL与新辅助治疗后得的CRC的预后关系。Anitei等[38]用免疫分数方法评估术前放化疗直肠癌患者中免疫浸润总T细胞(CD3+)和CTL(CD8+)的密度对患者预后的影响，结果显示两者均与肿瘤复发、患者生存期相关，并且肿瘤组织中的CD3+和CD8+淋巴细胞的高度浸润与放化疗后的肿瘤分期降低相关，进而认为治疗前确定组织中的免疫浸润细胞可能为预测对术前放化疗反应提供有价值的信息。近期的一篇Meta分析[4]总结肿瘤浸润淋巴细胞在原发性和转移性CRC中的研究，纳入了新辅助治疗的CRC和转移性CRC研究共25项，研究发现CD3+、CD8+、FOXP3+和CD45RO+的高密度浸润与原发性CRC的总体存活率有关，并且发现在局部的晚期直肠癌中，CD8+细胞水平是放疗后肿瘤消退程度良好的重要预测因子。因此治疗前确定TIL可有助于预测CRC患者生存期及放化疗后的效果。

2.2 肿瘤浸润B细胞与CRC预后的关系 B细胞是来源于造血干细胞的主要体液免疫细胞，目前肿瘤免疫的关注集中在T细胞，而忽略了B细胞在此领域的重要性。肿瘤浸润淋巴B细胞(tumor-infiltrating B cells，TIBs)和其亚型的分化受到TME调节，TIB具有对肿瘤双重作用：一是TIB不仅可以通过分泌细胞因子、提呈抗原和分泌抗体来抑制肿瘤的发展；二是还可以通过分化为调节性B细胞(regulatory B cells，Bregs)作用于肿瘤细胞或抑制NK细胞和T细胞的功能并促进Tregs的转化来促进肿瘤的进展[39]。免疫球蛋白Gκ链(IGKC)是B细胞基因的代表性标志，Schmidt等[40]分析1 810例乳腺癌、1 056例非小细胞肺癌、513例CRC和426例卵巢癌患者的基因芯片数据，发现IGKC与乳腺癌、CRC和非小细胞肺癌患者DFS显著相关，而与OS无显著相关性，认为IGKC有望成为癌症治疗反应的首选免疫标志物。Berntsson等[41]研究TIBs与浆细胞与CRC预后关系，分析CD20、CD138和IGKC在CRC中的表达，发现免疫细胞特异性CD20、CD138和IGKC表达与较低的T期显著相关，CD20的高密度浸润与OS改善显著相关，CD138是不良预后的独立因素。布力布等[42]研究CRC组织中B细胞转位基因3(BTG3)蛋白的表达情况，发现CRC组织中BTG3蛋白表达阳性率低于癌旁组织， TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、未侵及浆膜、无淋巴结转移和肝转移患者CRC中 BTG3蛋白表达阳性率高于TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、肿瘤侵及浆膜、伴淋巴结转移和肝转移患者，该结果提示，B细胞数量与CRC的发生、发展有关。Lv等[43]研究结果与上述研究一致，BTG3蛋白低表达与患者的病理学分型、浸润深度、远处转移、TNM分期、DFS和OS呈正相关，因此敲低BTG3可能会增强CRC的侵袭能力。

2.3 肿瘤浸润NK细胞与CRC预后的关系 NK细胞在不事先识别抗原的情况下识别和杀死肿瘤细胞，同时还释放趋化因子和细胞因子，包括CCL5、XCL-1/XCL-2和FLT3配体以及募集其他免疫细胞(如树突状细胞)[44-45]。在实体肿瘤中，外周血中的肿瘤相关NK细胞(tumor-associated NK cells, TANK cells)和肿瘤浸润NK细胞(tumor-infiltrating NK cells, TINK)会受到 TME衍生的多种因子如TGF-β、前列腺素E2、可溶性HLA-G、腺苷等的影响，显示双重功能。一方面，这些因子可以抑制NK细胞介导的活性，但另一方面，它们可以诱导NK细胞促进肿瘤血管生成[46]。NK细胞的常见标记是CD57和CD56。在目前关于NK细胞与CRC预后的研究开展较少。Liska等[47]团队发现CRC组织中的CD57+细胞是OS的重要独立阳性预后因素，CD57+细胞在肿瘤浸润低的患者发生短OS的风险高2.5倍。Vycital等[48]的研究结果与上述结果相似，他们分析152例Ⅱ/Ⅲ期CRC手术的患者，证实了CD57+细胞、颗粒酶B和CD8+T细胞是OS的阳性预后因素，而CD57+细胞和CD4+T细胞是复发的阳性预后因素。Jobin等[49]团队以结肠镜为标志，对全血中的NK细胞活性的测试以87%的敏感度、60.8%的特异度、5.7%的阳性预测值和99.4%的阴性预测值鉴定出患有CRC患者，该测试可在临床实践中用于评估患者患CRC的风险。还有研究证实了NK细胞可以在CRC中分辨出正常细胞与肿瘤细胞[50]，且NK细胞可作为转移性CRC的有效免疫治疗方法[44]。

3 展望

随着不断深入研究TIL在肿瘤免疫中的作用，将会了解更多不同的淋巴细胞亚群，不同亚群对肿瘤发生发展的作用不同。为改善患者预后，可望对TIL浸润密度较低的患者，通过增加TIL数量，特别是增加CD8+T细胞和记忆性CD45RO+T细胞数量；对Th2或Tregs比例较高患者，通过清除或抑制两者功能，提高CRC患者抗肿瘤免疫能力。“免疫分数”的方法有望用于CRC患者预后的评估，指导临床工作但还需进一步完善其方法的标准化。