MTHFR基因多态性对冠心病合并高血压患者氯吡格雷耐受性的影响

黎国德， 许庆波， 韩克栋

茂名市人民医院心血管内科(广东茂名 525000)

冠状动脉粥样硬化性心脏病又称为冠心病，是由于机体脂质代谢异常，在血液中形成的脂质会沉积于动脉内膜上，逐渐累积形成类似于粥样脂类物质的白色斑块，随后引起血管腔狭窄或者阻塞，从而引起血流受阻，造成心肌缺血、缺氧或者坏死，最终导致心脏病[1-2]。在临床上常常将冠心病分为慢性心肌缺血综合征(又称为稳定性冠心病)和急性冠状动脉综合征两种[3]。据2017年全球疾病负担国际合作研究报道，冠心病是全球病死率最高的疾病，多发于中老年人，且男性患者多于女性，已成为全球各个国家最常见的病种之一[1]。据不完全统计，全球冠心病的患者人数已高达1.1亿，每年死于冠心病的人数接近900万。而在我国，从近期中国疾病预防控制中心的研究报告显示，随着老龄化进程的加剧，我国冠心病的发病和死亡人数在不断增加，已成为我国病死率最高的疾病之一[1,4]。有研究表明，冠心病主要的发病机制是冠脉血管内皮发生损伤，形成白色斑块，随后出现斑块溃疡、破裂以及血小板黏附聚集等，导致血栓形成，心肌缺血等[5]。流行病学研究发现，冠心病的危险因素包括高龄、吸烟、高血压、血脂异常、糖尿病、高总胆固醇(total cholesterol，TC)等，其中高血压是冠心病的主要危险因素，随着患者血压的升高，冠心病的发病率和病死率均呈现上升的趋势[6-7]。氯吡格雷是一种P2Y12受体拮抗剂，需要经过肝脏P450酶代谢产生活化物质后，才能选择性不可逆地抑制血小板ADP受体，从而阻断P2Y12依赖激活的血小板膜糖蛋白复合物，减少ADP介导的血小板激活和聚集[8-9]。氯吡格雷的半衰期是6 h，常规剂量的起效时间为2～8 h，常常与阿司匹林联合使用，主要用于心肌梗死患者[1, 10-11]。亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)主要存在于肝脏组织中，是肝脏代谢过程中的关键酶[12]。MTHFR主要位于染色体 1p 36.3，有20多种基因突变位点，其中以C677T 和 A1298C 位点最为常见，而C677T基因型主要是C/T发生突变从而引起酶活性和功能的改变，A1298C基因型则是A/C发生突变后可能会影响酶的功能，进而影响药物在机体的吸收和代谢[13-14]。因此，本研究拟通过研究MTHFR C677T和A1298C基因多态性与冠心病合并高血压患者氯吡格雷耐受的相关性，为不同MTHFR基因型的冠心病患者提供更为合理的治疗方案，增强临床疗效和个性化用药提供一定的科学理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年5月至2019年1月在本院接受诊治的95例冠心病患者，其中合并高血压(GC组)的患者50例，男27例，女23例，年龄为(61.7±9.4)岁，体质指数(BMI)(27.7±3.9)kg/m2；不合并高血压(C组)的患者45例，男21例，女24例，年龄为(61.4±10.1)岁，BMI(28.1±3.6)kg/m2。两组患者年龄、性别、BMI等比较差异无统计学意义(P>0.05)。入组标准：经冠状动脉造影提示冠状动脉狭窄≥50%，确诊为冠心病，包括慢性冠心病和急性冠脉综合征的患者；依据2014年中国高血压防治指南诊断为高血压，即每隔2周测量1次，连续血压收缩压≥140 mmHg，舒张压≥90 mmHg的患者；无严重肝肾等重要器官功能不全的患者。剔除标准：既往口服过氯吡格雷的患者；继发性高血压患者；近期有严重出血史、造血系统疾病、恶性肿瘤等疾病的患者。

1.2 主要试剂与仪器 引物合成(生工生物工程(上海)股份有限公司)；全血DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)；限制性内切酶(生工生物工程(上海)股份有限公司)；Taq DNA聚合酶(Takara)；化学试剂均为分析纯(广州市西陇化工有限公司)等。PCR扩增仪(杭州博日科技有限公司)；Maestro GEN超微量分光光度仪(美国Maestro公司)等。

1.3 治疗方案与观察指标 所有患者都采用联合口服75 mg氯吡格雷[赛诺菲(杭州)制药有限公司]和100 mg阿司匹林(拜耳医药有限公司)进行治疗，同时口服单硝酸异山梨酯(鲁南贝特制药有限公司)等常规药物。于入院后第2天和服药后第6天用二磷酸腺苷专用抗凝管采集大约5 mL的静脉血，检测血小板抑制率，同时于次日清晨抽取2 mL的静脉血，进行血常规检测，3 mL的静脉血检测肝肾功能、血脂等指标；然后取部分静脉血用于全血DNA的提取。

入院前记录患者的一般资料(姓名、性别、年龄、身高、体重等)，既往服药情况，入院后进行血常规检测、肝肾功能检测、血脂检测[包括三酰甘油(TG)、胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)等]。观察两组患者MTHFR基因多态性分布特点以及各基因型的比例，分析两组不同基因型患者与口服氯吡格雷耐受性的相关性。

1.4 全血DNA的提取 采用全血基因组DNA提取试剂盒并严格按照说明书提取两组患者的血样DNA，随后通过Maestro GEN超微量分光光度仪检验提取的DNA的纯度。

1.5 基因型分析 通过聚合酶链式反应(PCR)和限制性内切片段长度多态性(RFLP)法(PCR-RFLP)分析MTHFR基因型。基因名称及其引物序列见表1。94℃下解链5min，随后94℃下变性30 s，60℃下退火30 s，72℃下延伸30 s，共35个循环；然后在72℃下再延伸5 min，1个循环。

表1 基因名称及其引物序列

2 结果

2.1 一般资料的比较 两组患者的血常规、TC、TG、HDL和LDL等差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.2 两组患者基因型分布特征比较 经过检测发现，本研究中所有患者的MTHFR C677T和MTHFR A1298C各基因型的分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。在GC组中，MTHFR C677T的CT基因型突变的频率最高(52%)，TT基因型次之，CC基因型突变频率最低，T等位基因的频率高达68.4%；而MTHFR A1298C的AA基因型突变频率最高(54%)，AC基因型次之，CC基因型突变频率最低，A等位基因的频率高达82.3%。在C组中，MTHFR C677T中各基因型的突变频率与GC组类似，CT>TT>CC，T等位基因的频率为64.3%；而MTHFR A1298C中各基因型的突变频率也与GC组差不多，AA>AC>CC，A等位基因的频率为78.4%。两组患者各基因型之间的差异无统计学意义(P>0.05)。不同基因型分布特征见表3。

项目例数吸烟史[例(%)]饮酒史[例(%)]TG(mmol/L)TC(mmol/L)HDL(mmol/L)LDL(mmol/L)GC组5014(28.0)21(42.0)1.86±0.744.24±1.411.21±0.512.53±1.03C组4511(24.4)18(40.0)1.64±0.814.06±1.331.10±0.892.26±0.942/t值0.3470.2161.3542.1533.1140.984P值0.5810.2270.1840.0870.2690.131

表3 两组患者MTHFR各基因型分布特征及等位基因频率比较 例(%)

2.3 不同基因型患者氯吡格雷耐受情况比较 在本研究中，GC组患者有50例，出现氯吡格雷耐受的患者有30例，占60%，而C组患者有45例，出现氯吡格雷耐受的患者有24例，占53.3%，两组患者在氯吡格雷耐受性比率上的差异无统计学意义(P>0.05)。但是，不管是GC组还是C组，MTHFR C677T的CT基因型患者中出现氯吡格雷耐受的比率明显高于CC基因型患者和TT基因型患者，其差异有统计学意义(P<0.05)；而MTHFR A1298C三种基因型患者中出现氯吡格雷耐受的比率差异并无统计学意义(P>0.05)。见表4。

3 讨论

随着社会老龄化进程的加剧，全球范围内冠心病的发病率和病死率都在不断升高，已经成为了全球病死率最高的疾病，严重威胁着全世界人民的生命健康[1-2]。据研究表明，冠心病的危险因素主要有年龄、吸烟、高血压、血脂异常、糖尿病、总胆固醇等，其中高血压是冠心病的主要危险因素，随着患者血压的升高，冠心病的发病率和死亡率均呈现上升的趋势[15]。一般来说，冠状动脉病变的狭窄程度和部位将决定患者缺血症状和预后情况，当管腔狭窄<50%时，心肌供血并不会受到太大的影响，当管腔狭窄>50%时，运动、心动过速或者激动都会引起心脏耗氧量升高，进而引起短暂性的心肌供血不足，导致慢性稳定性心绞痛，而当粥样斑块发生破裂、糜烂或者出血时，就容易形成血栓，进而引起血流受阻，造成心肌缺血、缺氧或者坏死，引发急性心肌梗死[16-17]。因此，为了能够更好地控制冠心病的发病率和死亡率，寻找更加合理的治疗方案，构建个体化用药和精准医学的体系，全球相关临床和科研人员都致力于探究不同患者应用不同药物治疗冠心病的作用机制，期望更好地提高药物的临床疗效。

表4 不同基因型患者对氯吡格雷耐受性的影响

氯吡格雷是《冠心病合理用药指南(第2版)》中主要用于预防心肌梗死和改善预后的一种常用药物[1]，它是一种P2Y12受体拮抗剂，需要经过肝脏P450酶代谢产生活化物质后，才能选择性不可逆地抑制血小板ADP受体，从而阻断P2Y12依赖激活的血小板膜糖蛋白复合物，减少ADP介导的血小板激活和聚集[8, 18]。虽然氯吡格雷治疗冠心病的临床疗效是毋庸置疑的，但是它最大的缺点就是存在较大的个体差异，导致有一部分的患者无法获得较好的治疗效果，反而出现氯吡格雷抵抗，甚至是卒中等不良事件，堪称一把冠心病的“双刃剑”[11, 19-20]。张惠娟等[21]通过观察高血压合并冠心病患者应用氨氯地平、氨氯地平联合氯吡格雷的临床治疗效果，发现氯吡格雷联合氨氯地平用于治疗高血压病合并冠心病，能够明显提高临床疗效和改善心功能。而刘炳博等[22]通过对冠心病患者经皮冠状动脉支架植入术 (PCI)后氯吡格雷发生抵抗的因素进行分析发现，高龄、 糖尿病、高血压和慢性肾脏病等都会使患者出现氯吡格雷抵抗的情况，需要给予替代药物来降低缺血事件引起大风险，改善PCI的预后情况。Savonitto等[23]通过临床研究发现老年患者在急性冠脉综合征后发生缺血和出血并发症的风险明显高于年轻患者，并且表现出更高的氯吡格雷血小板反应性。因此，在临床应用氯吡格雷的时候需要进行全方位的判断和分析，以便更好地提高临床疗效的同时，减少不良事件的发生。

Wang等[2]通过监测不同患者GP89基因多态性与冠心病、血脂、血糖和血压的变化，发现GP89基因145位点发生突变后能够显著影响患者血脂、血糖、血压等指标，从而影响冠心病的预后情况，该研究表明影响冠心病的临床疗效还可能是与不同患者基因型发生了突变有关。已有研究[24]发现，MTHFR主要存在于肝脏组织中，是肝脏代谢过程中的一种关键酶。MTHFR主要位于染色体 1p36.3，主要由11个外显子和10个内含子组成，编码区序列长2.2 kb，研究[13]发现其5′端非编码区经常会发生选择性剪接，且MTHFR有20多种基因突变位点，表明MTHFR基因存在表达上的复杂性。其中以C677T 和 A1298C 位点最为常见，在不同国家、不同地区和不同个体中，C677T 和 A1298C 位点的基因型分布具有显著的差异。MTHFR C677T基因型主要是C/T发生突变从而引起酶活性和功能的改变，而A1298C基因型则是A/C发生突变后可能会影响酶的功能，进而影响药物在机体的吸收和代谢[25]。Zhu等[26]通过观察和分析甲氨蝶呤与不同儿童恶性肿瘤患者MTHFR基因多态性的相关性发现，MTHFR C677T多态性的基因分型可能是减少毒性和改善个性化甲氨蝶呤治疗的重要依据。而在冠心病的治疗方面，MTHFR作为血浆同型半胱氨酸(Hcy)代谢过程中的关键酶，可以通过催化N5，N10-亚甲基四氢叶酸还原成 N5-甲基四氢叶酸，然后促使Hcy再甲基化形成蛋氨酸，以维持Hcy的正常血浆水平，预防冠心病的发生和发展，而当MTHFR C677T基因型中C等位基因突变成T等位基因时，会导致丙氨酸被缬氨酸所取代，进而促使酶活性降低，引起血浆中Hcy的水平显著提高，最终加剧冠心病的进展[27-29]。还有研究[30-31]通过观察分析MTHFR C677T基因多态性与老年原发性高血压患者粥样硬化斑块形成的相关性发现，MTHFR C677位点C等位基因突变成T等位基因，有可能会增加老年高血压患者粥样斑块形成的风险。

本研究选取了95例冠心病患者，其中合并高血压(GC组)的患者50例，不合并高血压(C组)的患者45例，两组患者的血常规、TC、TG、HDL和LDL等指标以及年龄、性别、BMI、饮酒、吸烟等差异并无统计学意义(P>0.05)，排除了冠心病其他危险因素对氯吡格雷耐受的影响。经过检测发现，本研究中所有患者的MTHFR C677T和MTHFR A1298C各基因型的分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。在GC组中，MTHFR C677T的CT基因型突变的频率最高(52%)，TT基因型次之，CC基因型突变频率最低，T等位基因的频率高达68.4%；而MTHFR A1298C的AA基因型突变频率最高(54%)，AC基因型次之，CC基因型突变频率最低，A等位基因的频率高达82.3%。在C组中，MTHFR C677T中各基因型的突变频率与GC组类似，CT>TT>CC，T等位基因的频率为64.3%；而MTHFR A1298C中各基因型的突变频率也与GC组差不多，AA>AC>CC，A等位基因的频率为78.4%。两组患者各基因型之间的差异并没有统计学意义(P>0.05)，说明MTHFR C677T和MTHFR A1298C是否发生突变与冠心病是否合并高血压之间没有直接关系。随后，本研究发现GC组患者50例，出现氯吡格雷耐受的患者有30例，占60%，而C组患者45例，出现氯吡格雷耐受的患者有24例，占53.3%，两组患者在氯吡格雷耐受性比率上的差异并没有统计学意义(P>0.05)。但是，不管是GC组还是C组，MTHFR C677T的CT基因型患者中出现氯吡格雷耐受的比率明显高于CC基因型患者和TT基因型患者，其差异有统计学意义(P<0.05)，表明当MTHFR C677T患者的C等位基因突变为T等位基因后，患者对氯吡格雷耐受的几率明显升高，MTHFR C677T的CT基因型可能是导致氯吡格雷耐受的主要遗传因素。而MTHFR A1298C患者的三种基因型中出现氯吡格雷耐受的比率差异无统计学意义(P>0.05)，表明MTHFR A1298C与患者出现氯吡格雷耐受可能并无直接关系。

本研究提示，MTHFR C677T的C/T发生基因突变后，可能会不同程度地影响冠心病合并高血压患者对氯吡格雷的耐受性，而MTHFR A1298C发生基因突变后可能并不会影响患者对氯吡格雷的耐受性，这可能是因为MTHFR基因表达或突变会被机体不同的因素所调控。这结果提示我们不同个体之间存在不同的基因型分布特征，在使用药物时不仅要考虑个体疾病的复杂性和交叉性，还需要不同个体基因型的特征，才能够更好地提供治疗方案，提高临床疗效。基于现有研究成果上，后续将对不同地区、不同生活习惯和环境的患者进行区分和观察分析，并进一步扩大样本量，增加对氯吡格雷耐受的评价指标和因素，以期提供更为合理更为准确的临床数据，为构建个性化治疗体系提供更多的科学依据。