基于网络药理学的益母草注射液止血调经作用机制研究Δ

李佳霖，吴嘉瑞，贾珊珊，刘殊羽，刘鑫馗，倪梦蔚，刘莹莹，王郝嘉

(北京中医药大学中药学院，北京 102488)

益母草注射液是益母草单味药材经水煎、醇沉、精滤和灭菌等一系列工艺加工制成的纯中药制剂[1]，对自然分娩产后出血、剖宫产产后出血、排卵障碍性子宫出血、子宫复旧不全和月经不调等均有疗效[2-5]。益母草注射液可引起全子宫的持久兴奋，增加子宫收缩的张力、强度和幅度，其发挥止血作用不仅与促进子宫收缩有关，还与调节内源性凝血时间而促进止血等有关[6-7]。益母草注射液所含的水溶性生物碱是发挥子宫收缩作用的主要物质基础[8]；在水溶性生物碱中，起主要作用的是水苏碱、胆碱和葫芦巴碱[9-10]。网络药理学是整合了系统生物学、多向药理学和网络分析学等学科的一门新兴学科[11]；其研究策略的整体性、系统性的特点与中药多成分、多靶点和多途径的特点高度吻合，已被广泛用于中药活性成分的预测以及中药作用机制的研究[12-13]。本研究应用网络药理学方法，从现代医学角度初步分析、预测益母草注射液发挥止血调经作用的分子机制，为深入开展益母草注射液机制研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 益母草注射液活性成分的收集

通过查找相关文献和阅读药品说明书，获取已报道的益母草注射液的活性成分，最终将具有止血调经作用的水苏碱、胆碱和葫芦巴碱纳入研究，通过PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)查找并导出活性成分二维化学结构数据。

1.2 活性成分靶点的预测

依托中药系统药理学数据库和分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，寻找化合物的靶点蛋白；通过PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)寻找活性成分的Smiles结构，并分别输入SuperPred数据库(http：//prediction.charite.de/)、Swiss Target Prediction数据库(http://swisstargetprediction.ch/)中进行预测基因靶点；通过STITCH数据库(http://stitch.embl.de/)，直接查找活性成分的基因靶点[限定物种为“智人(Homo sapiens)”]。收集以上3种方式检索得到益母草注射液活性成分的所有基因靶点。

1.3 疾病靶点的查找

治疗靶点数据库(therapeutic target database，TTD)(https://db.idrblab.org/ttd/)是一个提供已知或正在探索的可用作治疗的蛋白质靶点和核苷酸靶点信息，以及与之相对应的靶疾病、靶通路和相应的药物/配体信息的数据库[14]。遗传药理学与药物基因组学数据库(pharmacogenetics and pharmacogenomics knowledge base，PharmGKB)(http://www.pharmg-kb.org/)是一个收集完整的与药物基因组相关的基因型和表型信息，并将这些信息系统归类的数据库。以“hemorrhage”“dysmenorrhea”和“excessive bleeding following childbirth”等疾病为关键词，在TTD、PharmGKB数据库中进行搜索，收集疾病作用的靶点基因。

1.4 “化合物-靶点”网络和“疾病-靶点”网络的构建

利用Cytoscape 3.6.1软件(http://www.cytoscape.org/)，构建益母草注射液的化学成分与相应靶点的网络，同时构建疾病与疾病靶点的网络。Cytoscape 3.6.1是一个生物信息分析软件，应用于可视化生物通路、分子间相互作用网络等，其提供了一套基本的数据整合、分析和可视化的功能，用于复杂网络的分析，对于交互网络中的每个节点，通过计算重要参数“度”来评估其拓扑特征[15]。度定义为节点i的边数，度越高，表示节点越重要。

1.5 蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络的构建

由于蛋白质很少独立发挥其功能，因此，通过研究蛋白质功能群来了解PPI是很重要的，STRING 10.5数据库(https://string-db.org/)正是这样一个储存已知和预测PPI的数据库。将收集到的所有化合物靶点基因输入到STRING数据库中进行检索，限定物种为“智人(Homo sapiens)”，选取置信度>0.7的PPI关系数据[16]。将PPI关系数据导入Cytoscape软件中绘制PPI网络，并对网络进行分析(Cytoscape→Tools→Network analyzer→Network analysis→Analyze network)。在网络中，将节点大小设置为反应度值的大小。同理，将疾病靶点基因输入STRING数据库中进行检索，重复以上步骤。分别得到化合物靶点的PPI网络、疾病靶点的PPI网络。

1.6 PPI网络合并

运用Cytoscape软件中的Merge功能，将化合物靶点的PPI网络与疾病靶点的PPI网络取交集，除去不相交的基因，2个网络之间的共同靶点可能是益母草注射液发挥止血调经作用的潜在作用靶点[17]。

1.7 富集分析

为说明益母草注射液发挥止血调经作用靶点在基因功能和信号通路中的作用，将潜在的作用靶点导入DAVID数据库(https：//david.ncifcrf.gov/)，进行基因本体(gene ontology，GO)生物学过程富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)代谢通路富集分析。DAVID平台列表与背景均设置为“智人(Homo sapiens)”进行操作[18]。选取错误发现率(false discovery rate，FDR)<0.01的数据，分别利用Excel和Cytoscape软件建立柱状图和“药物-成分-靶点-通路”网络模型图。

2 结果

2.1 益母草注射液活性成分

经过文献挖掘与整理，选取益母草注射液中3个主要活性成分进行研究，见表1。

表1 纳入研究的益母草注射液活性成分Tab 1 Active ingredients of motherwort injection

2.2 益母草注射液“活性成分-靶点”网络的构建

益母草注射液的3个活性成分在TCMSP、STITCH、SwissTargetPrediction及SuperPred等数据库中预测得到的靶点共58个，去除重复靶点后得到靶点56个。将活性成分和预测靶点的信息导入Cytoscape软件，构建“活性成分-靶点”网络，见图1。图中，正中间3个节点代表益母草注射液的3个活性成分，活性成分靶点位于四周，各化合物节点与其对应的靶点节点间形状相同，节点的大小与节点的度呈正比例关系，边代表化合物与作用靶点之间的联系。

图1 益母草注射液“活性成分-靶点”网络Fig 1 “Active Ingredient-Target” network of motherwort injection

2.3 益母草注射液“疾病-靶点”网络的构建

从TTD、PharmGKB数据库中共检索到53个与出血和月经不调等疾病相关的靶点。将疾病和预测靶点的信息导入Cytoscape软件，构建“疾病-靶点”网络，见图2。图中，方形节点代表益母草注射液可能治疗的相关疾病，圆形节点代表与疾病相关的作用靶点，节点的大小与节点的度呈正比例关系，边代表疾病与作用靶点之间的联系。

2.4 PPI网络的构建

2.4.1 化合物靶点的PPI网络：将56个化合物靶点输入STRING数据库中，设置置信度为0.7，蛋白相互关联度为20，得到PPI关系文本，进而得到PPI关系表格，导入Cytoscape软件中绘制PPI网络，见图3。该网络共涉及59个节点，202条边，节点表示蛋白，每条边代表PPI关系，节点的大小与节点的度呈正相关。

图2 益母草注射液“疾病-靶点”网络Fig 2 “Disease-Target” network of motherwort injection

图3 化合物靶点的PPI网络Fig 3 PPI network of compound target

2.4.2 疾病靶点的PPI网络：将在TTD、PharmGKB数据库中得到的53个靶点输入STRING数据库中，设置置信度为0.7，蛋白相互关联度为20，得到PPI关系文本，进而得到PPI关系表格，导入Cytoscape软件中绘制PPI网络，见图4。该网络共涉及62个节点，202条边，节点表示蛋白，每条边代表PPI关系，节点的大小与节点的度呈正相关。

图4 疾病靶点的PPI网络Fig 4 PPI network of disease target

2.5 网络合并

运用Cytoscape(Version 3.6.1)软件中的Merge功能，将益母草注射液活性成分靶点的PPI网络与相关疾病的PPI网络合并取交集(Tools→Merge→Intersection→Merge)，重合的基因则可能为益母草注射液发挥止血调经作用的潜在靶点。共得到9个潜在靶点蛋白，分别为PTGS1、PTGS2、CYP2D6、CYP1A2、CYP3A4、CYP2C9、CYP2C19、NCOA2和RXRA；其中，度值较大的靶点为CYP2C19、CYP2C9、CYP3A4、CYP1A2、PTGS1和PTGS2，见表2。

2.6 GO和KEGG富集分析

2.6.1 GO功能富集分析：利用DAVID平台进行GO功能富集分析，对合并网络后涉及的9个靶点蛋白在基因功能中的作用进行研究。选取FDR<0.01的25个GO条目，其中，与分子功能相关的条目有11个，主要涉及血红素结合(GO：0020037)、氧气结合(GO：0019825)、铁离子结合(GO：0005506)和酶结合(GO：0019899)等；与生物学过程相关的条目有11个，主要涉及药物代谢过程(GO：0017144)、药物分解过程(GO：0042737)和肝药酶CYP通路(GO：0019373)等；与细胞组分相关的条目有3个，为细胞器膜(GO：0031090)、内质网膜(GO：0031090)和细胞内与细胞膜结合的细胞器(GO：0043231)，见表3、图5。

表2 益母草注射液止血调经的潜在靶点信息Tab 2 Information on potential targets of motherwort injection for hemostasis and regulating menstruation

2.6.2 KEGG通路富集分析：利用DAVID平台的KEGG通路富集分析功能，对上述25个蛋白在信号通路中的作用进行研究，共得到11个通路，根据FDR<0.01筛选出5条信号通路，见表4、图6。图6是对益母草注射液靶点进行KEGG分析的气泡图，Y轴表示靶基因显著富集的KEGG途径，X轴表示通路中靶基因的数目；富集因子代表属于该通路的靶基因数量与位于该通路中所有注释基因数量的比值，富集因子越大，代表富集程度越高；点的大小表示通路中的靶基因数量，且点的颜色深浅反映了不同的P范围。所筛选到的通路包括“Serotonergic synaps”(含血清素的神经突触)信号通路、“Drug metabolism-cytochrome P450”(药物代谢-肝药酶CYP)信号通路、“Chemical carcinogenesis”(化学致癌作用)信号通路、“Linoleic acid metabolism”(亚油酸的新陈代谢)信号通路和“Arachidonic acid metabolism”(花生四烯酸代谢)信号通路，推测益母草注射液的有效成分可能通过作用于上述通路来达到治疗疾病的目的。

表3 益母草注射液止血调经的相关GO富集分析条目Tab 3 List of GO functional enrichment analysis of motherwort injection for hemostasis and regulating menstruation

图5 潜在靶点的GO分析Fig 5 GO enrichment analysis of potential target

表4 益母草注射液止血调经的相关KEGG通路分析条目Tab 4 List of KEGG pathway enrichment analysis of motherwort injection for hemostasis and regulating menstruation

图6 KEGG途径富集分析不同模块的靶标Fig 6 KEGG pathway enrichment analysis for targets in different modules

2.7 “药物-成分-靶点-通路”网络模型构建

益母草注射液“药物-化合物-靶点-疾病”网络见图7，共包括65个节点，其中1个药物节点，3个化合物节点，56个靶点节点，5个通路节点；图中，菱形节点代表药物，正六边形节点代表化合物，圆形节点代表靶点，三角形节点表示益母草注射液潜在的治疗靶点，正方形节点代表信号通路，节点的大小与节点的度成正比关系。该图体现出了益母草注射液多成分、多靶点和多疾病的复杂作用特点。

图7 益母草注射液“药物-活性成分-潜在靶点-作用通路”网络Fig 7 “Drug-Active Ingredient-Potential Target-Action Pathway” network of motherwort injection

3 讨论

益母草注射液具有止血调经的功效，临床上主要用于治疗产后出血、月经不调等妇科疾病。为了更好地探究益母草注射液止血调经的作用机制，本研究依托网络药理学方法，构建了“化合物-靶点”“靶点-疾病”和“药物-化合物-靶点-疾病”等网络，分析了化合物与靶点、靶点与疾病以及药物之间的相互作用关系。益母草注射液所涉及到的关键靶点主要包括PTGS2、PTGS1、CYP2C19、CYP2C9和CYP2D6等，上述靶点参与调控的疾病主要包括出血症、月经不调和功能失调性子宫出血等；对其潜在治疗靶点进行了GO功能富集和KEGG通路富集分析，得到富集潜在靶点的通路5条，潜在靶点通过5条通路相互作用，为益母草注射液多成分、多靶点和多途径的治疗机制研究提供了参考。

前列腺素内过氧化物合酶(PTGS)是一种花生四烯酸合成前列腺素类物质的关键性限速酶，目前已知至少有2种同功异构体，即PTGS1和PTGS2。PTGS及其产物参与机体的凝血平衡、炎症反应等多种生理病理过程。PTGS1为结构型，在大多数细胞内呈稳定表达，产生多种生理学功能，如调节血小板聚集和肾血流量[19]。PTGS2是引起炎症反应的关键酶之一，可促进炎症反应。当细胞受到生长因子、细胞因子和炎症递质等刺激因素的影响时，前列腺素E2(PGE2)浓度增加，引起子宫平滑肌收缩，提升子宫平滑肌紧张度与收缩频率[20-22]。因此，益母草注射液治疗产后子宫出血的作用机制可能与调控PTGS表达有关，对PTGS的调控具体表现在调节血小板聚集、增加子宫收缩力等方面，这可能在治疗产后子宫出血的过程中发挥重要作用。排卵障碍性异常子宫出血是异常子宫出血的最常见原因，为临床常见疾病，其致病机制为，下丘脑-垂体-卵巢轴功能异常引起持续性无排卵，雌激素持续作用于子宫内膜，引起雌激素突破性出血或撤退性出血，故单一雌激素的长期作用是出血的主要原因[7]。体外实验研究结果表明，通过静脉或第三脑室注射PGE2能促进促性腺激素的分泌。研究结果显示，排卵障碍性异常子宫出血患者外周循环中PTGS2表达量较正常对照组明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)，PTGS2作为前列腺素合成的关键酶可催化花生四烯酸合成多种前列腺素，作用于下丘脑，调节促性腺激素释放激素的分泌，导致排卵障碍性异常子宫出血的发生[23]。而益母草注射液止血的机制可能是抑制PTGS2表达，减少前列腺素的合成，进而减少单一雌激素的分泌，防止出血。PTGS2也可参与月经的发生，月经前期，子宫内膜腺上皮细胞PTGS2表达增加并催化合成前列腺素，子宫肌层受到刺激而收缩，导致子宫内膜功能层的螺旋小动脉发生持续痉挛现象，使子宫内膜血流减少，组织变性坏死，发生月经。若PTGS2的表达过高，则会引起子宫肌层持续收缩，发生痛经。由此可见，益母草注射液对 PTGS的调控可能在治疗痛经、调节月经的过程中发挥着重要的作用。

肝药酶CYP系统多位于细胞内质网上，催化多种内源、外源物质的代谢。肝药酶CYP能通过其结构中的血红素中的铁离子传递电子，氧化异源物质，增强异源物质的水溶性，使异源物质更易排出体外。肝药酶CYP有多个亚家族，其中与心血管相关的酶包括CYP2D6、CYP2C9、CYP2C19、CYP1A2和CYP3A4等5种。研究结果表明，CYP2C19基因携带者对血小板的抑制率高于野生型患者，而血小板在止血、伤口愈合及炎症反应等生理和病理过程中有着非常重要的作用，CYP2C19基因突变可降低药物的抗血小板作用[24-26]。强效血小板抑制剂能抑制ADP、花生四烯酸、胶原、凝血酶和血小板活化因子等引起的血小板聚集，并对血小板聚集的各阶段都有抑制作用，抑制CYP2C19基因的表达，使血小板聚集抑制率降低，可增强凝血效果[26-29]。因此，益母草注射液治疗产后子宫出血的作用机制可能与调控CYP2C19基因表达有关，其对CYP2C19的调控表现在调节血小板聚集程度从而达到凝血效果。

GO功能富集分析结果发现，益母草注射液治疗出血性相关疾病可能主要通过对肝药酶CYP的生物合成的调控、对药物的反应、与血红素结合、与氧结合和对类固醇激素代谢方面的调控。KEGG通路富集分析结果发现，药物代谢-肝药酶CYP通路和含血清素的神经突触通路中均富集了CYP2C9、CYP2D6和CYP2C19基因，这些通路之间存在很强的关联性，说明1个基因可能参与出血相关疾病的多条通路，而益母草注射液对于出血性疾病的治疗也可能是通过对多条通路共同作用实现的。由此推测，益母草注射液的有效成分可能通过作用于上述靶点，影响信号通路，达到治疗疾病的目的。

综上所述，本研究应用网络药理学方法，对益母草注射液的多成分、多靶点与多种疾病间复杂的关系进行了研究。研究结果初步阐释了益母草注射液止血调经的基本药理学作用和相关机制，并为进一步深入探讨其作用机制奠定了良好的基础和参考依据。