一个复合杂合突变导致的遗传性凝血因子XII缺陷症家系分析

李少禧，李小龙，金艳慧，杨丽红，张海月，王明山

（温州医科大学附属第一医院 医学检验中心，浙江 温州 325015）

人类凝血因子XII（FXII）是由肝脏合成的一种丝氨酸蛋白酶原，成熟的蛋白质由596个氨基酸残基所组成，在外周血血浆中的浓度为30～35 μg/mL， 半衰期为50～70 h[1]。FXII在内源性凝血途径启动中起着重要的作用，先天性FXII缺陷症是一种常染色体隐性遗传病。根据FXII促凝活性（FXII:C）和FXII抗原（FXII:Ag）在血浆中的水平不同，分为3种类型：I型是交叉反应物质阴性型（CRM-），即抗原检测不到；II型为交叉反应物质阳性型（CRM+），即抗原水平正常；III型为交叉反应物质降低型（CRMRed），即抗原水平降低。有研究表明[2-4]，FXII缺陷通常不会发生自发性出血症状，反而是血栓形成的一个危险因素。本研究对一个复合杂合F12 基因突变导致的遗传性FXII缺陷症家系进行表型与基因检测，并采用生物信息学相关软件对其基因突变的位点进行分析，初步探讨其分子致病机制。

1 对象和方法

1.1 对象 先证者，男，50岁，浙江平阳人，因创伤性右肱骨骨折入院，平常无异常出血史或血栓形成史。常规的术前检查发现活化部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time，APTT）为59.1 s，明显延长（参考范围为29.0～43.0 s），进一步的凝血因子检测显示FXII:C下降，只有4%，FXII:Ag下降，只有5%（参考范围为72%～130%）。其他实验指标如凝血酶原时间（prothrombin time，PT）、凝血酶时间（thrombin time，TT）等均在正常参考范围，纤维蛋白原（fibrinogen，FIB）偏高，为4.44 g/L（参考范围为2～4 g/L），初步诊断为FXII缺陷症。在得到先证者和家系成员知情同意的前提下，采取了其他4位家系成员的外周血以分析FXII缺乏的原因。家系谱见图1。同时，选择100名本院健康体检者作为健康对照组，男57名，女43名，年龄22～60岁，无肝肾功能异常，无异常出血史和血栓史，且采样已征得本人同意。本研究经温州医科大学附属第一医院伦理学委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 样品采集与处理：采集受检者外周静脉血2.7 mL，以0.109 mol/L枸橼酸钠1:9 抗凝， 3 000 r/min离心10 min，上层乏血小板血浆用于凝血指标检测，并于2 h内完成，下层血细胞用于提取基因组DNA，并进行PCR扩增及测序。

图1 遗传性FXII缺陷症家系图

1.2.2 血浆凝血指标检测：PT、APTT、凝血因子VIII促凝活性（FVIII：C）、凝血因子IX促凝活性（FIX：C）、凝血因子XI促凝活性（FXI:C）和FXII:C等凝血指标采用一期凝固法在法国Stago STA-R全自动血凝仪上测定（配套试剂由法国Stago公司提供）；FXII:Ag采用ELISA法测定。所有操作步骤均严格按照试剂说明书进行。

1.2.3 DNA提取及PCR扩增：采用酚-氯仿法抽提受检者的外周血基因组DNA，参照文献[5]设计合成PCR引物（由上海桑尼生物科技有限公司合成）。PCR扩增：反应体积共50 μL，包括Taq PCR Mastermix 25 μL，ddH2O 18 μL，DNA模板3 μL，正向引物2 μL，反向引物2 μL。反应条件：95 ℃预变性 5 min，95 ℃变形30 s，根据不同引物分别以相应退火温度（60～64 ℃）退火30 s，72 ℃延伸45 s （共35个循环），72 ℃延伸10 min。

1.2.4 DNA序列分析：PCR扩增产物纯化后送上海桑尼生物工程有限公司直接测序，所用测序仪为ABI PRISM 3730。测序结果用Chromas软件与美国NCBI基因库所公布的F12 基因序列（Genbank AF538691） 进行比对，寻找基因突变位点。发现基因突变的序列则反向测序予以证实，再扩增其他家系成员相应外显子片段。对100名健康对照组人群相应的区域进行PCR扩增、测序，用于排除基因多态性。

1.2.5 保守性分析和生物信息学预测：采用多序列比对软件ClustalX-2.1-win将突变氨基酸与其他7种同源物种（家鼠、褐家鼠、泛穴居人、猕猴、犬狼疮属、金丝猴、刺叶黄耆）的氨基酸序列进行比对，分析突变氨基酸在物种进化过程中的保守性。并用4个在线生物信息学软件（Mutation Taster、Poly-Phen-2、PROVEAN和SIFT）预测氨基酸替换是否会影响FXII蛋白的功能和结构。

1.2.6 突变蛋白空间结构模型分析：以蛋白数据库（PDB，http://www.rcsb.org/pdb/home/home/do.PDB，ID：4XDE）中的3D结构为基础，用Swiss-PDB Viewer 4.0.1软件和蛋白质相互作用计算器程序（http://pic.mbu.iisc.ernet.in）生成蛋白质模型，分析F12 基因突变前后由氨基酸变化引起蛋白质空间结构的改变。

2 结果

2.1 凝血指标检测结果 先证者APTT为59.1s（参考范围29.0～43.0 s），明显延长，FXII:C降低至4%，FXII:Ag降低至5%；其父亲、母亲和女儿APTT均为正常，FXII:C和FXII:Ag降低至32%～37%，其妻子各指标均正常，见表1。先证者及家系其他成员PT、FVIII:C、FIX:C和FXI:C也均在参考范围内（未列出）。

表1 家系成员实验室表型和基因型分析结果

2.2 DNA序列分析结果 除常见的46C/T多态性（先证者和其父亲为46C/T杂合型，其余3个家系成员均为46C/C野生型）外，先证者F12 基因第13号外显子存在复合杂合基因突变，即c.1561G＞A杂合错义突变（p.Glu502Lys）和c.1637T＞C杂合错义突变（p.Met527Thr）；其父亲为p.Met527Thr携带者，母亲和女儿为p.Glu502Lys携带者（见表1和图2）。基因检测结果与凝血指数检测结果相应。对100例健康对照者F12 基因13外显子进行测序，均未发现c.1637T＞C，排除基因多态性。查阅国内外文献及相关网站，c.1637T＞C突变位点未见报道。

2.3 生物信息学分析 同源序列比对分析显示在现代智人和其他7 种同源物种（家鼠、褐家鼠、泛穴居人、猕猴、犬狼疮属、金丝猴、刺叶黄耆）里Glu502和Met527是个高度保守的序列（见图3）。根据4个生物信息学软件对p.Glu502Lys突变的预测结果为“致病的”“良性的”“有害的”和“影响蛋白功能”；而对p.Met527Thr突变的预示为“致病的” “可能危害性”“有害的”和“影响蛋白功能的”（见 表2）。蛋白模型3D分析的结果显示Glu502 替换为Lys502 导致Glu502-His365 之间氢键的消失；Met527替换为Thr527导致Thr527-Leu524之间增加2条氢键（见图4）。

图2 F12 基因第13号外显子测序结果

图3 保守性分析图表（箭头所指为目标氨基酸）

3 讨论

本家系的研究结果显示，先证者F12基因的第13号外显子上存在复合杂合基因突变，即p.Glu502Lys 杂合错义突变和p.Met527Thr杂合错义突变，其FXII:C和FXII:Ag均极度降低；其父亲为p.Met527Thr携带者，母亲和女儿为p.Glu502Lys携带者，FXII:C和FXII:Ag均有不同程度降低。其妻子F12 的基因型为Glu502和Met527野生型，FXII:C和FXII:Ag均为正常。同时，先证者和其父亲F12 基因1号外显子上46位为46C/T基因型，其余家系三成员均为46C/C基因型，这也表明46C/T这个基因多态性并不引起这个家系FXII活性和抗原性的下降。此外，没有其他因素导致FXII活性和抗原的下降，且在复合杂合FXII缺陷里FXII:C及FXII:Ag降低的程度也和许多报道一致[6-7]。由此推断p.Glu502Lys和p.Met527Thr这种复合杂合突变导致了FXII活性和抗原的降低。

遗传性FXII缺陷症是一种罕见的常染色体隐性遗传疾病。FXII严重缺乏的个体常常表现为体外实验APTT延长而体内并无出血倾向[8]。有研究结果表明[3]，复合杂合子突变的FXII活性和抗原水平比单个杂合子的更低，且几乎所有的复合杂合突变和纯合突变有一样的表型特征，即FXII活性和抗原水平极低。该先证者的FXII活性和抗原水平同步显著下降，为III型FXII缺陷症（CRM-），提示这个突变蛋白的合成、分泌和功能受到了损害[9]。通过家系图，可以看出该先证者的复合杂合突变p.Glu502Lys和p.Met527Thr遗传自其父亲和母亲，这种遗传模式与其他遗传性FXII缺陷症患者的常染色体隐性遗传模式相符。p.Met527Thr突变为国际上首次报道，而p.Glu502Lys已经有过报道[6-7]。

为了进一步探讨p.Glu502Lys和p.Met527Thr突变对FXII水平的影响，本研究分析了这些位点保守性和突变对蛋白的可能影响。保守性分析结果表明，Glu502和Met527在同源物种间高度保守，表明这些位点在FXII常规功能中发挥了关键的作用。信息生物学的结果显示p.Glu502Lys和p.Met527Thr突变很可能是有害突变，会影响FXII的结构和功能，从而导致疾病的发生。

表2 生物信息学软件分析结果

图4 模型分析图

Glu502和Met527位于FXII蛋白轻链催化域（催化三联体His393-Asp442-Ser544)，其中Met527靠近有活性的Ser544。进一步研究表明FXII蛋白的催化域在372～614的氨基酸残基区，在蛋白的酶活性功能中是个关键部位。为了分析突变对蛋白空间结构的影响，本研究运用了模型分析，结果显示Glu502替换为Lys502导致了Glu502-His365之间氢键消失；Met527替换为Thr527导致了Thr527-Leu524之间增加2条氢键。氢键的联接对维持蛋白空间构象和稳定有着重要作用，因此，这些改变可能影响了催化域微妙的空间结构从而导致FXII蛋白的激活及活性。对Glu502Lys的体外实验表达研究发现，突变蛋白在细胞的前高尔基体里被广泛降解，从而导致了突变蛋白的低水平表达[7]。通过对突变FXII蛋白（p.Gly531Glu）的功能研究发现，该突变导致FXII对激肽释放酶原的裂解活性存在局部缺陷[3]。由于Met527位点靠近Gly531，我们推测p.Met527Thr突变蛋白与p.Gly531Glu一样存在功能缺陷。

综上所述，本研究在一个遗传性FXII缺陷症患者身上发现了两种错义突变（p.Glu502Lys和p.Met527Thr），这些突变可能导致了催化域空间结构的改变，从而降低了FXII的活性和抗原水平，但其确切分子致病机制有待进一步研究。