聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制剂的应用与耐药机制

欧阳芊, 张一琼

南昌大学第一附属医院妇产科(江西南昌 330006)

卵巢癌(ovarian cancer)是病死率最高的女性生殖道恶性肿瘤[1]。尽管目前卵巢癌的手术治疗及联合化疗已取得了较大的进步，但其病死率并无明显变化[2]。目前，治疗卵巢癌的药物已不局限于单药烷化剂方面，还涉及多西他滨等其他化疗药物。随着对卵巢癌发病机制的不断研究以及分子靶向治疗取得的新进展，靶向药物通过靶向联合靶向、单药、化疗联合靶向等多方面对肿瘤细胞予以特异性杀伤，这也为卵巢癌的治疗提供了新的策略[3-4]。目前发现约 20 个遗传易感基因与遗传性卵巢癌密切相关，其中 65%～85%的遗传性卵巢癌的发生由乳腺癌易感基因(breast cancer susceptibility gene，BRCA) 1/2 的胚系突变导致。BRCA 是重要的抑癌基因，BRCA 1/2 基因是评估乳腺癌、卵巢癌和其他相关癌症发病风险的重要生物标志物，BRCA 1/2 的遗传性突变增加了携带者卵巢癌的患病风险[5]。随着卵巢癌分子靶向治疗的进展，靶向药物通过多种途径特异性地杀伤肿瘤细胞。多腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly (ADPribose) polymerases，PARPs]抑制剂(PARPi)可用于多种 DNA 的修复过程，当DNA 修复机制缺陷时，PARPi可促使肿瘤细胞优先死亡。世界卫生组织批准将PARPi应用于临床，为晚期及复发性卵巢癌患者提供了新的治疗选择[6]。尽管FAD已经批准了4种PARPi在临床上使用，但其耐药性还普遍存在，并通过多种机制发展。现对PARPi的应用及耐药性机制作一综述[7]。

1 PARPi的应用

当前使用的大多数抗癌药物属于破坏DNA的化学试剂，治疗的效率很大程度上取决于癌细胞中的DNA修复系统。癌症反复复发，反复化疗，导致从铂敏感转变成铂耐药，且有些患者难以耐受化学药物的毒性不良反应导致治疗中断。因此，癌症治疗中，PARP酶成为最有希望的分子靶标之一[8]。真核生物蛋白质的聚腺苷二磷酸核糖化[poly (ADP-ribosyl) ation]是一种重要的蛋白质翻译后修饰过程, 其是由一类PARPs催化介导的，其与单链 DNA 损伤修复密切相关[9]。PARPi目标是PARP酶(主要是PARP1和PARP2)，其催化带负电荷的聚(ADP-核糖)聚合物，形成DNA损伤传感器(PAR)链调节蛋白装配和调质动力学响应于基因毒性应激。值得注意的是，PARP不仅与维持基因组稳定性有关，而且在其他细胞环境中也具有功能，包括染色质重塑、转录和mRNA加工，它们在细胞分化、胚胎发育、炎症、新陈代谢、癌症发展中起着重要作用[10-11]。甚至还有研究发现PARPi可以通过阻止PARP1与环状GMP-AMP合酶(cGAS)的相互作用来预防肿瘤发生[12]。PARPi构成了一类新的抗癌疗法。PARP酶参与单链DNA断裂的修复。抑制PARP会导致DNA双链断裂，可以通过同源重组进行修复。然而，BRCA突变细胞在同源重组修复中存在缺陷,所以尽管同源重组修复的缺陷和单独的PARP抑制均不是细胞毒性，但这两种条件的组合(称为合成致死性)可导致双链DNA断裂的积累和细胞死亡[13]。

在1994年和1995年分别发现BRCA1和BRCA2基因之后，PARPi的治疗开发始于2005 年。与其他生物制剂相比，PARPi具有改变卵巢癌治疗模式的潜力，这有几个原因。首先，大约15%～21%的高度浆液性卵巢癌可能带有BRCA突变[14]。另外，这些肿瘤中约有50%可能具有同源重组缺陷，因此可能对PARPi有反应。PARPi具有普遍可接受的毒性和耐受性特征，且可口服，易于管理。值得注意的是，对铂敏感(38%)和铂耐药(30%)疾病的响应率均相近。临床数据表明PFS明显延长，并且在接受大量卵巢癌治疗的患者中通常耐受良好。PARPi olaparib的毒性主要有疲劳、胃肠道相关的不良事件和骨髓抑制组成。然而，经过对药物的了解及对其毒副作用的管理，使治疗能够继续。PARPi由于其独特的作用机制，口服制剂和易于给药，为卵巢癌的治疗提供了一种新颖的方法[13]。

虽然PARPi的作用机制尚未完全了解，并可能涉及多个分子事件，包括修复蛋白募集到DNA损伤位点受损，复制叉逆转失控和复制叉稳定性降低，以及PARP捕获和有毒PARP形成，都可能引起相关DNA复制损伤形成DNA损伤复合物，很显然，PARPi的作用目标，是存在同源重组(HR)能力受损的细胞[15]。

PARP1 对于机体维持稳定性至关重要，但还有矛盾的另一方面，当 DNA 大量广泛损伤时，PARP1会过度激活，消耗大量 NAD +，继而耗竭 ATP，导致细胞坏死，PARPi应减轻细胞坏死并保护组织，这与传统的抗肿瘤治疗途径是相反的，因此PARPi 会造成对治疗的抗性[8]。

2 PARPi的耐药机制

2.1 同源重组修复 由于预先存在的HR缺陷是允许PARPi杀死HR缺乏的肿瘤的先决条件，因此以下任何恢复HR的疾病都可能导致对PARPi的抵抗[16]。

2.1.1 继发性BRCA1/2突变 PARPi耐药性被广泛接受的机制是通过继发性突变恢复BRCA1或BRCA2蛋白功能，继而恢复HR途径。与BRCA缺失相关的基因组不稳定性可能是BRAC反向突变的原因。通过对c.6174delT移码突变进行基因内删除，发现表达PARPi耐药性的人类胰腺癌细胞系表达新的BRCA2亚型，从而恢复了BRCA2基因的开放阅读框(ORF)，从而可以通过HR修复DSB。该机制为铂耐药及PARPi耐药共同共有。通过顺铂/ PARPi组合体外选择对铂和PARPi均敏感的BRCA2突变卵巢癌细胞系，可使继发性BRCA2突变诱导的BRCA2功能恢复。发现从铂耐药复发性卵巢癌患者腹腔积液中提取的卵巢癌细胞具有继发性BRCA2突变，并且具有BRCA2优势。BRCA2的耗尽使这些细胞对顺铂/PARPi组合重新敏感[17]。在患有种系BRCA1/2突变的女性癌症中，可通过继发性体细胞突变恢复BRCA1/2。从而可预测对铂化疗的耐药性，也可预测对PARPi的耐药性。且经过Barber等[18]的研究，2例患者最初均对PARPi产生了良好反应，随后出现了耐药性病变。通过观察经PARPi治疗后的细胞发现，其均与达尔文方式选择的携带罕见继发性BRCA2突变的抗肿瘤细胞克隆相符。且某些BRCA1缺陷型肿瘤在其种群中携带亚型BRCA1突变，因此选择具有恢复BRCA功能的细胞可以赋予对PARPi的抗性[16]。以上研究皆证实PARPi耐药性的产生与继发性BRCA1/2突变相关。

2.1.2 53BP1路径 在没有继发性BRCA1/2突变的情况下，非同源DNA末端连接(NHEJ)的过度激活可能是PARPi耐药性的原因之一[19]。在细胞损伤类型中，DNA双链断裂(DSB)弊端显著，因为双链断裂可能导致染色体插入，缺失或易位，而NHEJ是整个细胞周期中DSB的主要修复途径，几乎涵盖了S期和G2期以外的所有DSB修复阶段[20]，由于DNA末端的构型不均匀，因此NHEJ必须具有高度的灵活性，即使如此在修复过程中极易出错[21]。HR和NHEJ竞争处理DNA复制过程中出现的DNA断裂，并且可以利用改变修复途径之间的平衡来选择性保护或杀死具有BRCA突变的细胞。HR和NHEJ之间的平衡通常由BRCA1调节的TP53结合蛋白1(53BP1)维持，p53结合蛋白1(53BP1)是细胞对DSB应答的重要调节因子，可促进DNA远端的末端连接[22]。且在BRCA1基因突变阳性及HR阳性的肿瘤中53BP1将转移至NHEJ。从机制上讲，53BP1通过抑制HR修复所需的DNA末端的广泛核仁切除来促进NHEJ，因此，各种原因引起的53BP1功能丧失有助于BRCA1独立末端切除并表达PARPi耐药性。后续研究发现53BP1介导的修复下游因子如RIF1和REV7的失活也导致DNA末端切除的恢复，从而促进了同源介导的修复，恢复了HR功能，并使对PARPi的敏感性增加[23]。有研究发现缺失53BP1可以显著减少Brca1缺陷小鼠的乳腺肿瘤的发生，并且缺乏53BP1和Brca1基因的肿瘤在HR中严重受损，因此对使用PARPi实现合成杀伤力的疗法敏感[24]。

2.1.3 复制叉 目前相关研究表明在不产生BRAC2恢复突变的BRAC2缺陷型肿瘤细胞中，获得性PARPi耐药性和顺铂耐药性与复制叉保护有关[25]。在DNA损伤修复过程中，PARP1被募集到单链DNA损伤的位点，随后HR效应子在相关因子的作用下也募集于此。由于HR效应子的募集，使得复制叉的移动速度减慢，促进DNA修复[26]。最近的一份报告指出，在BRCA1/2缺陷的细胞中，复制叉移动速度减慢可增加复制叉的稳定性，且细胞因此获得对PARPi的耐药性。Ray Chaudhuri等[25]研究显示HR修复蛋白PTIP的缺失，保护BRCA1/2缺陷细胞免受DNA损伤，并且使BRCA1/2缺陷的胚胎干细胞免于致死。但是，PTIP的缺乏不能在双链断裂时恢复同源重组活性。相反，PTIP的缺失会抑制MRE11核酸酶募集到停滞的复制叉中，从而保护复制叉，使其免于被降解，也最终形成了对PARPi的耐药性[25,27]。在DNA复制期间，拓扑异构酶解旋DNA，以防止扭转力的积累。拓扑异构酶的抑制导致复制叉的不稳定，并促进DNA断裂。拓扑异构酶抑制是一种公认的抗癌治疗方法,通过拓扑异构酶抑制剂与PARPi结合靶向针对于停滞的复制叉作用可以增强抗肿瘤作用[28-30]。多种蛋白(包括PARP1和CHD4)的破坏可导致相同的复制叉停止移动，突显了肿瘤细胞规避化学疗法干预并获得耐药性的复杂性[25]。

2.2 改变细胞周期进行调控 在细胞周期G1到S期发生的信号传导会诱导许多HR修复效应子的上调，所以HR修复高度依赖于细胞周期阶段[31]。RAD51是一种关键的HR蛋白，因此，任何增加RAD51水平或活性的因素都可能导致对PARPi的耐药[16]。在一个对PARPi olaparib耐药的细胞基因组中发现， BRCA1/2和RAD51可提高PARPi敏感性。RAD51的水平受到miR-96、Aurora-1和PTEN的影响，PTEN与RAD51水平呈正相关，miR-96和Aurora-1则可抑制RAD15的表达，当RAD51活性增加时，HR活性也增加，从而导致对PARPi的耐药性。一项对RAD51水平升高使结肠癌细胞对PARPi和替莫唑胺联合治疗产生耐药性的观察结果间接支持了这一结论。此外还发现细胞周期调节剂细胞周期蛋白依赖性激酶12(CDK12)是PARPi敏感性的临床相关生物标志物，在高级浆液性卵巢癌(HGS-OVCa)模型中发现，CDK12下降通过同源重组抑制DNA修复，导致DNA修复蛋白下调，提高PARPi敏感性，人为的建立“BRCAness”表型，并降低BRCA1表达[32-33]。据2016年两项体外研究报道，Dinaciclib(一种细胞周期蛋白依赖性激酶CKD1、2、5、9的抑制剂)对CDK12的药理抑制作用可逆转PARPi耐药性，增加其敏感程度，将肿瘤生长抑制转化为持久消退[34-35]。WEE1，另一种细胞周期调节剂，可通过使细胞周期停滞发生DNA修复。因此，对WEE1抑制将迫使细胞进入细胞周期的S期，在HR缺乏和PARP抑制的情况下，将导致DNA DSB的进一步积累即间接抑制同源重组，使PARPi耐药性增加[36]。

2.3 药物外排 无论是化学疗法还是靶向疗法，肿瘤细胞都能通过增加药物外排泵(p-糖蛋白)阻止抗癌药物在细胞内积累，使药物外排增加，减弱药物的治疗作用，使其表现耐药性。将olaparib的治疗剂量和维持剂量应用于BRAC缺陷小鼠乳腺肿瘤细胞，发现在BRAC-null和P53-null的小鼠乳腺肿瘤细胞中，一些P-糖蛋白(Abcb1a、Abcb1b、Abcc1、Abcg2)明显增加[37]。对P-糖蛋白表达增加的细胞进一步研究发现，应用P-糖蛋白抑制剂tariquidar进行治疗可阻止HCT116结肠癌细胞中PARPi的减少，使肿瘤的耐药性逆转，即对PARPi再次敏感，并促进肿瘤消退。目前已有大量针对P-糖蛋白的靶向研究，希望通过应用P-糖蛋白抑制剂来克服治疗的耐药性，但是由于其复杂的药物毒性，不良的药物相互作用和许多药代动力学问题，P-糖蛋白抑制剂尚未取得临床成功[27,38]。

2.4 信号转导 MET/HGFR和PI3K/AKT信号传导在很大程度上依赖于激酶活性。异常的MET/HGFR和PI3K/AKT信号均已被证实对肿瘤的发生和PARPi耐药性的发生有利。在10%的卵巢癌细胞中发现酪氨酸激酶受体MET/HGFR被扩增或上调。酪氨酸激酶受体(c-Met)与Tyr907处的PARP1结合并磷酸化，PARP1 Tyr907的磷酸化增加了PARP1的酶促活性，并减少与PARPi的结合，从而使癌细胞具有对PARPi的抵抗力[39]。且还发现c-MET的上调或扩增与PARPi的不敏感性和耐药性有关。PI3K/AKT途径是致癌的信号传导途径，在包括卵巢癌在内的多种癌症的发生中起着至关重要的作用。抑制PARP会诱导Akt的磷酸化和激活[40]，所以通过PARPi降低PARP1的活性可以导致PI3K/AKT途径的上调。这表明增加的PI3K/AKT信号传导可使PARPi耐药性增加[41]。

2.5 miRNA环境 研究发现，hsa-miR-107和hsa-miR-222可通过抑制RAD51的表达来调节DDR(DNA损伤反应)，并使肿瘤细胞对PARPi敏感。进一步通过对miRNA进行模拟筛选，发现了几种 miRNA的高表达会导致PARPi的高敏感性[42]。相关研究已经确定miR622的调控可影响PARPi的敏感性，miR622可选择性抑制NHEJ组件(Ku70 / 80)的表达，即当miR-622过度表达时可挽救BRCA1突变型卵巢肿瘤的HR缺陷，并诱导对PARPi产生耐药性[43]。不仅如此，机体还可通过抑制或下调Artemis或DNA-PK(NHEJ组件)来增强其对PARPi的耐药性[16]。另一项研究表明miR-182对BRCA1的表达呈负调控，可通过下调BRCA1水平，诱导细胞对PARPi产生耐药性。且在动物模型中发现，表达miR-182肿瘤的生长会受PARPi影响[44]。因为PARP-1与BRCA2启动子的沉默子结合区结合,所以PARP-1及其活性是BRCA2的负调节剂。因此，PARPi介导的PARP-1活性抑制可能导致BRCA2的过表达和对PARPi的耐药性[16]。

2.6 PARP表达 据报道，人体内有17种具有不同活性的PARP酶参与DNA修复。在目前的PARPi中，olaparib和veliparib是PARP1和PARP2的高度选择性抑制剂。但是，其他抑制剂(niraparib、rucaparib等)的作用范围更广。PARPi在抗癌治疗中的有效性要求其靶PARP-1可被抑制，因为在经过PARPi处理的细胞中，PARP-1仍将与断裂的DNA链结合，但不会被激活形成PAR或促进DNA修复事件。因此，降低的PARP-1水平可能导致对PARPi的耐药性。PARPi的有效性也与PARP-1的催化活性有关。因此，任何降低PARP-1活性的因素都可能影响PARPi的功效。具有PARP-1正常水平但内源性PARylation水平降低表明酶活性降低的癌细胞对PARPi有更强的抵抗力。因此，具有较高内源性PARylation活性的HR缺陷型肿瘤细胞对PARPi更加敏感[16]。所有PARPi的化学结构均不同，并且具有脱靶效应[45]。PARPi的结构差异表明，继发PARPi的使用可能在抗药性肿瘤中有效。例如，对奥拉帕尼产生抗药性的患者可以随后用尼拉帕利治疗，但仍需进一步研究其他PARPs的补偿性表达对促进PARPi抗性的影响[27]。

3 结论

本文讨论了FDA批准的PARPi，其疾病适应证、应用、耐药性以及克服耐药性的选择。对PARPi耐药性的不同机制的透彻了解可使我们能够设计出更好的PARPi单药疗法和联合疗法，并使我们能够确定可使肿瘤细胞重新对PARPi敏感的疾病，从而更有效地治疗癌症患者。展望未来，无论BRCA的状态或HR缺乏如何，都有足够的数据表明PARPi在铂敏感的高级别卵巢癌的治疗和维持治疗中的使用正在扩大。但是，在HR缺乏的情况下， PARPi反应的机制仍不明确。将来，阐明PARPi敏感性的非HR独立机制将是一个重要的研究领域。重要的是，在临床中可通过扩大PARPi的使用，使更多的肿瘤患者从此获益。总而言之，PARP抑制代表着高级浆液性卵巢癌的临床管理发生了重大变化。