PTTG抑制PI3K/AKT信号通路诱导皮肤鳞状细胞癌细胞凋亡的机制

2020-03-05任永强李庆华黄新建

临床与实验病理学杂志 2020年1期

任永强，李庆华，黄新建，董丽

皮肤鳞状细胞癌(简称皮肤鳞癌)来源于皮肤的鳞状上皮组织，是我国常见的皮肤恶性肿瘤之一，好发于老年人，至今病因尚未明确，认为可能与化学致癌剂、慢性炎症、人乳头瘤病毒感染等有关[1]。因此，了解皮肤鳞癌的发病机制，寻找其发生过程的关键分子，对于其诊疗具有重要意义。垂体肿瘤转化基因(pituitary tumor transforming genes, PTTG)是新近发现的一个原癌基因，参与细胞增殖、凋亡、分化及信号转导等，与肿瘤发生、发展密切相关[2]。有研究表明，PTTG在多种肿瘤组织和细胞中高表达，如食管鳞状细胞癌、结直肠癌等，其高表达可促进肿瘤细胞增殖[3]。有关皮肤鳞癌中PTTG的研究较少，文献报道下调PTTG基因表达可明显抑制皮肤鳞癌细胞的增殖和迁移，下调MMP-2和MMP-9的表达，并在裸鼠移植瘤模型中得到证实[4-5]。PI3K/AKT信号通路是细胞内一条重要的信号途径，参与细胞增殖、凋亡、侵袭转移等过程，其激活可促进肿瘤细胞生长[6]。PTTG是否可抑制PI3K/AKT信号通路影响皮肤鳞癌细胞凋亡还未明确。因此，本实验通过RNA干扰(RNAi)抑制人皮肤鳞癌细胞系A431中PTTG的表达，旨在探讨抑制PTTG表达对A431细胞活力、凋亡的影响，并进一步探讨对PI3K/AKT信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、青霉素和链霉素均购自美国Gibco公司；MTT、DMSO、ROS检测试剂盒均购自美国Sigma公司；Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡试剂盒、流式细胞仪均购自美国BD公司；LY294002及PTTG、AKT、p-AKT、Cyclin D1和Bax抗体均购自美国CST公司；酶标仪购自美国Thermo公司。

1.2 细胞培养人皮肤鳞癌细胞系A431购自中国科学院上海细胞库。细胞使用含10%FBS的DMEM培养基，在5%CO2、37 ℃细胞培养箱中常规传代培养。实验为生长至对数期的细胞。

1.3 转染转染前1天，以每孔3×105个接种生长至对数期的A431细胞于6孔板，每孔2 mL，次日，待细胞达70%～80%生长融合度时进行转染。转染参照Lipofectamin 2000试剂盒说明。转染4 h后，更换为含血清的完全培养基，于培养箱中常规孵育48 h。收获细胞，进行后续实验研究。实验分组：空白组(未转染的空白细胞)(n=3)、NC组(转染无干扰作用siRNA)(n=3)和si-PTTG组(转染si-PTTG)(n=3)，每组设3个重复。

1.4 MTT法检测细胞活力以每孔1.0×104个接种A431细胞于96孔板，每孔100 μL，于5%CO2、37 ℃、饱和湿度的培养箱内培养24 h，将si-PTTG转染至细胞，转染24、48和72 h，每孔中加入20 μL MTT(5 mg/mL)，培养箱内继续培养4 h，终止培养，每孔中加DMSO 200 μL，震荡10 min。酶标仪上，选择490 nm波长，调零后测定各孔的吸光度值(A)。以A值反映细胞活力。每组设置5个重复孔，实验重复3次。

1.5 Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率以每孔3×105个将si-PTTG平铺在6孔板内，转染48 h后，吸出细胞培养液，转移至离心管，用含1%FBS的PBS洗涤细胞，不含EDTA的胰酶消化细胞，离心，弃去培养液，收集(1～5)×105个细胞，参照Annexin V-FITC/PI试剂盒说明，通过流式细胞仪检测(1 h内)。实验重复3次。

1.6 Western blotsiRNA转染A431细胞48 h，提取细胞总蛋白。BCA法定量蛋白。按照每孔50 μg上样，经SDS-PAGE分离、转膜、封闭、洗膜，加PTTG、AKT、p-AKT、Cyclin D1和Bax一抗稀释液，4 ℃孵育过夜，洗膜，加HRP标记的二抗稀释液，室温孵育1～2 h，加ECL发光液，在暗盒中使用X光胶片曝光，拍照。Quantity One软件进行灰度值分析。以目的蛋白与内参GAPDH的灰度值比值为各蛋白的相对表达量。实验重复3次。

1.7 流式细胞术检测ROS含量siRNA转染A431细胞48 h，收集细胞，参照ROS检测试剂盒说明，将适量DCFH-DA加入所有孔中(上机前30 min)，培养箱中孵育30 min，胰酶消化细胞，离心，PBS洗涤细胞及重悬细胞后，通过流式细胞仪测定。实验重复3次。

2 结果

2.1 siRNA转染A431细胞后PTTG蛋白表达PTTG的特异性siRNA转染A431细胞48 h，采用Western blot法检测转染效果(图1)，si-PTTG组PTTG表达明显低于空白组(P<0.05)，而NC组与空白组PTTG表达差异无统计学意义(P>0.05)。

图1 Western blot法检测siRNA转染A431细胞后PTTG蛋白表达

2.2 沉默PTTG表达对A431细胞活力的影响MTT法检测转染si-PTTG的A431细胞活力，si-PTTG转染A431细胞24、48和72 h，细胞活力均明显降低，与空白组比较差异有统计学意义(P<0.05，图2)。

图2 沉默PTTG表达后的A431细胞生长曲线

2.3 沉默PTTG表达对A431细胞凋亡及ROS产生的影响si-PTTG转染A431细胞48 h，通过流式细胞术及ROS试剂盒分别检测细胞凋亡率及ROS水平，与空白组比较，si-PTTG组细胞凋亡率及ROS含量均明显升高(P<0.05，图3)。

2.4 沉默PTTG表达对A431细胞PI3K/AKT信号通路的影响Western blot法检测转染si-PTTG 48 h的A431细胞AKT、p-AKT、Cyclin D1和Bax蛋白的表达，结果显示，与空白组比较，si-PTTG组p-AKT和Cyclin D1表达明显降低，Bax表达明显升高(P<0.05，图4)。三组间AKT表达差异无统计学意义(P>0.05)。

2.5 抑制PI3K/AKT信号通路对A431细胞活力的影响与空白组比较，LY294002组细胞活力明显降低(P<0.05，图5)，而si-PTTG+LY294002组细胞活力明显低于LY294002组(P<0.05)。

2.6 抑制PI3K/AKT信号通路对A431细胞凋亡的影响LY294002组细胞凋亡率明显高于空白组，而si-PTTG+LY294002组细胞凋亡率高于LY294002组(P<0.05，图6)。

图3 流式细胞术检测沉默PTTG表达后的A431细胞凋亡率及ROS含量

图4 Western blot法检测沉默PTTG表达对A431细胞PI3K/AKT信号通路影响

图5 抑制PI3K/AKT信号通路后A431细胞生长曲线

3 讨论

人PTTG基因定位于染色体5q33，是新近发现的一种原癌基因，对血管生成、细胞周期调控、基因调控、染色体稳定性维持、细胞凋亡等多个方面均有调控作用[7]。正常组织中PTTG不表达或弱表达，而在肿瘤组织及细胞中呈明显高表达，其表达与肿瘤生长密切相关[8]。有研究显示，通过RNAi干扰PTTG基因表达可明显抑制脑胶质瘤细胞的增殖，阻滞细胞周期[9]。上述研究提示PTTG在肿瘤中的重要作用。已有研究表明，通过RNAi抑制PTTG表达可降低皮肤鳞癌细胞的增殖和转移[4]。本实验旨在探讨PTTG表达抑制对皮肤鳞癌细胞凋亡的影响及机制，结果显示，RNAi沉默PTTG表达可明显抑制皮肤鳞癌A431细胞活力，诱导细胞凋亡。提示抑制PTTG表达可能是皮肤鳞癌基因治疗的手段之一。

ROS是一类含氧的具有化学活性的分子，ROS适度升高对细胞增殖和分化具有促进作用，而过高的ROS水平可引起脂质、蛋白及DNA的氧化损伤。肿瘤细胞内ROS水平被诱导后继续升高，可引起细胞凋亡[10]。因此，诱导肿瘤细胞ROS产生已成为肿瘤治疗的手段之一。有研究表明，诱导皮肤鳞癌细胞ROS产生可明显促进癌细胞凋亡[11]。本实验结果显示，沉默PTTG表达可明显诱导A431细胞ROS产生。提示诱导ROS产生可能是沉默PTTG表达诱导皮肤鳞癌细胞凋亡的机制之一。

PI3K/AKT信号通路是细胞内与肿瘤密切相关的重要的信号途径，可通过促进肿瘤细胞增殖、存活、侵袭迁移、新生血管形成及抑制细胞凋亡等一系列方式促进肿瘤的发生、发展，因而成为肿瘤研究中的热点[12]。有研究表明，慢病毒介导的PTTG基因表达沉默可通过调节PI3K信号通路抑制垂体腺瘤细胞的增殖和侵袭能力[13]。Cyclin D1是一个细胞周期蛋白，可促进DNA转录合成，使细胞由G1期进入S期，Cyclin D1过表达可促进包括皮肤鳞癌细胞在内的多种肿瘤细胞生长[14]。BCL-2家族成员与细胞凋亡密切相关，Bax是BCL-2家族成员之一，发挥促凋亡作用，上调其表达可促进肿瘤细胞生长[15]。本实验结果显示，抑制PTTG基因表达可明显下调p-AKT和Cyclin D1表达，上调Bax表达，提示沉默PTTG表达可通过抑制PI3K/AKT信号通路降低皮肤鳞癌细胞生长。LY294002是PI3K/AKT信号通路抑制剂，可抑制多种肿瘤细胞生长。本实验结果显示，LY294002可抑制A431细胞活力，诱导细胞凋亡，并可增加沉默PTTG表达对A431细胞活力抑制和凋亡促进作用。提示沉默PTTG表达可通过抑制PI3K/AKT信号通路降低皮肤鳞癌细胞生长。