弹力纤维染色在评估胸腺瘤对纵隔胸膜侵犯的应用

秦 钢，邢 杰，吴佳君，张 杰，韩昱晨

目前，弹力纤维(elastic fibers, EF)染色是广泛应用于评估肺癌胸膜侵犯的方法，对肺癌的TNM分期至关重要，但在胸腺瘤诊断的实际工作中，纵隔胸膜侵犯对胸腺瘤的Masaoka-Koga分期也有重要意义。国际胸腺瘤协作组织(International Thymic Malignancy Interest Group, ITMIG)建议在尚无广泛被接受的分期方法之前，仍使用Koga等修订的Masaoka-Koga分期[1-3]。弹力纤维由弹力蛋白构成，在新鲜组织中呈黄色的细亮线条纹，也叫黄纤维；其纤维较细，交织成网状，使用常规HE染色较难区分[4-5]。本文旨在探讨EF染色对准确判断胸腺瘤有无胸膜侵犯及正确评估胸腺瘤Masaoka-Koga分期的作用。

1 材料与方法

1.1 材料收集上海交通大学附属胸科医院病理科2016年手术切除的胸腺瘤标本100例，肉眼可见肿瘤与胸膜或心包粘连，其中男性56例，女性44例，年龄30～75岁，平均60.98岁；所有患者术前均未接受放、化疗。每例取材6～7块，置于10%中性福尔马林中固定，常规脱水，包埋，3～4 μm厚连续切片2张，分别行HE染色和EF染色。

1.2 方法维多利亚蓝染液配制：取一只500 mL的烧杯，加入蒸馏水200 mL、维多利亚蓝2 g、糊精0.5 g、间苯二酚4 g，小火煮沸，另取一只烧杯煮沸30%三氯化铁25 mL，将其缓慢倒入维多利亚蓝混合液中，小火煮沸3 min，同时不断搅拌直至液体呈胶体状，冷却后过滤，将沉渣和滤纸放入60 ℃烘箱中烤干备用；取一只干净的烧杯放入70%乙醇400 mL溶解沉渣，加入盐酸4 mL和苯酚6 g作为防腐剂，4 ℃冰箱放置1周成熟后即可使用。

石蜡切片脱蜡后置于70%乙醇中清洗，在维多利亚篮染液中染色90～120 min，使用95%乙醇分化，蒸馏水冲洗干净，苏木精染色5 min，经盐酸乙醇浓液分化，热水返蓝，伊红复染，蒸馏水清洗干净后，自然干燥，中性树胶封固。镜下观察弹力纤维较细，呈蓝绿色波浪状，细胞核为蓝色，细胞质为红色。

2 结果

100例胸腺瘤标本均可见肿瘤与胸膜或心包粘连，其中HE染色发现肿瘤侵犯胸膜，经EF染色发现肿瘤细胞未侵犯弹力层46例(图1)；侵犯胸膜弹力层54例，14例通过HE染色无法准确判断，而采用EF染色后明显可见肿瘤细胞和胸膜之间的关系(图2)；对于心包浸润的判断，HE染色显示心包弹力板完整，但EF染色显示肿瘤细胞已破坏心包弹力层(图3)；也可见HE和EF染色均显示肿瘤细胞已破坏胸膜弹力层，仅保留部分胸膜的病例(图4)。

3 讨论

目前，Masaoka-Koga是较为广泛接受的胸腺瘤临床分期，肿瘤细胞是否侵犯胸膜(镜下证实)是区分Ⅱb期和Ⅲ期的重要依据，对于Masaoka-Koga分期Ⅲ和Ⅳa期胸腺瘤患者，多主张采用综合治疗，即术前化疗、手术、术后化疗或放疗，能够提高Masaoka-Koga分期Ⅲ和Ⅳa期胸腺瘤患者的生存期。

Masaoka-Koga对于Ⅲ期胸腺瘤的术语定义：肉眼见肿瘤侵犯邻近器官(如心包、大血管或肺)；国际胸腺瘤协作组织则给出更为详细的定义：包括肿瘤侵犯以下任何组织，如镜下侵犯纵隔胸膜(无论部分或侵透弹力纤维层)，或镜下侵犯心包(无论部分侵犯纤维层或侵透浆膜层)，或镜下证实直接侵透脏层胸膜或侵犯肺实质，或侵犯隔神经或迷走神经(镜下证实，仅粘连除外)，侵犯或侵透大血管结构(镜下证实)，与肺或周围器官粘连，且必须侵犯纵隔胸膜或心包(镜下证实)[3]。由此可见，EF染色对判断胸腺瘤的临床分期同样具有重要意义。

图1未侵犯胸膜：A.HE染色；B.EF染色图2A.无法准确判断肿瘤细胞是否突破弹力层(红色箭头)，HE染色；B.肿瘤细胞抵达胸膜下，但未突破弹力层(红色箭头)，EF染色图3A.心包弹力板完整(红色箭头)，HE染色；B.肿瘤细胞已破坏心包弹力层(红色箭头)，EF染色图4A.HE染色(红色箭头)；B.EF染色(红色箭头)，A图与B图均显示肿瘤细胞已破坏胸膜弹力层，仅保留部分胸膜

弹力纤维呈细丝状，主要成分为弹性蛋白，属于硬质蛋白，难以溶解，新鲜标本中呈黄色细亮条状，HE染色时，弹力纤维呈粉色，且较难与其他纤维组织区分。EF染色的原理：间苯二酚和三氯化铁结合成一种带有弱正电荷的染料，通过非极性吸着与结构致密的弹力纤维紧密结合完成染色，它们之间通过氢键相互连接[6]。弹力纤维是血管及肿瘤间质的重要组成之一，很多疾病均可引起弹力纤维的显著变化，如支气管扩张、肺癌等。由于肿瘤细胞与微环境中的细胞成分相互作用，诱导纤维母细胞增生，导致脏层胸膜和肿瘤组织之间出现纤维组织及血管增生，采用常规HE染色观察胸膜是否侵犯易被干扰。实际工作中，会遇到各种情况，如HE染色可以观察到胸膜上有肿瘤细胞浸润，但是无法判断胸膜是否有肿瘤细胞浸润；或者对于心包弹力板有无浸润的判断等。本组标本采用EF染色，可以清楚地判断胸腺瘤与脏层胸膜之间的关系，尤其是各种原因导致HE染色无法判断的14例胸腺瘤。因此，采用EF染色，可以对胸腺瘤患者进行准确分期、最佳的治疗方案和预后评价均有积极的意义。