结合恶性胸腔积液中脱落细胞探讨上皮细胞-间质转化与非小细胞肺癌的相关性

2020-03-05方长清丁春晓刘小虎李建华

临床与实验病理学杂志 2020年1期

方长清，丁春晓，刘小虎，王健，张恒，杜江，李建华

肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一。流行病学调查显示，每年肺癌位居恶性肿瘤新发病例的首位，在女性中位居第2位[1]。在其他国家，肺癌是美国癌症死亡的首要原因，早期肺癌患者行手术切除治疗预后较好，但该病通常早期无症状直到进展为晚期[2]。而在晚期患者中，肺癌组织往往会侵及周围组织或发生转移，当肿瘤侵犯胸膜时常常引起恶性胸腔积液(malignant pleural effusion, MPE)，甚至为血性，进而导致患者临床上出现气促等症状，因此，如何早期发现肺癌并有效控制早期肺癌的恶性进展是亟待解决的问题。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占肺癌的绝大部分，组织学类型包括腺癌、鳞癌及少见的大细胞肺癌等[3]。NSCLC一般早期症状不明显或仅出现非特异性的临床症状，因此患者发现时多已处于中晚期。既往大量活检组织学研究证明，在肺癌的发生、发展过程中，上皮细胞-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)与其密切相关，本实验重点探讨MPE中NSCLC的相关EMT免疫表型，即从细胞学角度进一步论证EMT与肺癌发生、发展的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料收集中国医科大学附属第一医院病理科2017年1月～2018年12月存档的胸水标本823例。其中女性423例，年龄56～78岁，中位年龄67岁；男性400例，年龄50～87岁，中位年龄72岁。对胸水标本诊断结果为可疑阳性及异性增生细胞进行离心沉渣包埋，行HE及免疫组化染色，通过病理诊断得到107例NSCLC胸水沉渣标本，该107例通过回访追踪，获得完整的临床资料。其中男性61例，中位年龄68岁；女性46例，中位年龄71岁。

1.2 试剂鼠抗人E-cadherin、N-cadherin单克隆抗体，兔抗人vimentin、β-catentin单克隆抗体购自福州迈新公司销售的美国Biox公司产品。免疫组化SP试剂盒和DAB显色试剂盒购自福州迈新公司。

1.3 液基细胞薄层检测(thinprep cytology test, TCT)收集新鲜胸水20 mL左右，室温下800 r/min离心5 min，弃去上清，取沉淀底层细胞，加入清洗液后再次离心，取沉淀与保存液混合后机器自动制片，手动中性树胶封固。

1.4 胸水沉渣包埋采用TCT常规制片、诊断后，每份对应标本收集新鲜胸水200 mL左右，经95%乙醇固定24 h后石蜡包埋、切片。

1.5 免疫组化免疫组化染色采用SP法，PBS缓冲液代替一抗作为空白对照，DAB显色，苏木精复染，常规脱水透明，中性树胶封固。

1.6 结果判定E-cadherin、N-cadherin阳性定位于细胞膜，vimentin阳性定位于细胞质，β-catentin阳性正常定位于细胞膜。在NSCLC细胞中，由于发生EMT，β-catentin膜表达减弱，胞质积聚或核异常积聚，所以在本实验中，β-catentin判读标准是非胞膜表达的异常阳性。阳性程度判断：细胞无阳性着色或阳性细胞数<10%为(-)；阳性细胞数10%～25%为(+)，26%～50%为()，≥51%为()；以(+～)为阳性。每张切片随机选取10个高倍视野(400×)，对免疫组化结果进行判读。

1.7 统计学分析采用SPSS 17.0软件对试验结果进行统计学分析，率的比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC病例的获得本实验结合以下几方面对NSCLC做出最终诊断：收集的823例胸水标本中，对TCT检查结果为可疑阳性或细胞异型增生的标本进行胸水标本沉渣包埋，进而行免疫组化染色，肺腺癌TTF-1、Napsin A、CK7等抗体阳性，肺鳞癌CK5/6、p40、p63、CK34βE12等抗体阳性，同时针对具体病例，应用多抗体进行鉴别诊断，如应用CR、MC、CK5/6、WT-1、EGFR、D2-40等抗体鉴诊NSCLC与恶性间皮瘤[4]；应用CK20、CDX2等抗体鉴别肺腺癌与转移性结直肠腺癌；应用ER、PR等鉴诊肺腺癌与转移性乳腺癌等。最后结合患者的临床症状与体征，如发病诱因(吸烟、职业和环境接触史、电离辐射、既往肺部感染、遗传因素等)、临床表现(胸部胀痛、痰血、低热、咳嗽等)、胸部X光片、支气管镜细胞学检查及术后组织学病理检查，最终确诊107例NSCLC作为研究病例。

2.2 E-cadherin、N-cadherin、β-catentin及vimentin在NSCLC细胞组、活检组及癌旁组织组中的表达E-cadherin在NSCLC细胞组、活检组中的阳性率分别为28.21%(11/39)、33.34%(11/33)，均显著低于NSCLC癌旁组织组(91.43%，32/35)(P<0.05，表1)。N-cadherin在NSCLC细胞组、活检组中的阳性率分别为53.85%(21/39)、57.58%(19/33)，均显著高于NSCLC癌旁组织组(14.29%，5/35)(P<0.05，表1)。β-catentin在NSCLC细胞组、活检组中的异常阳性率分别为79.49%(31/39)、84.85%(28/33)，均显著高于NSCLC癌旁组织组(17.15%，7/35)(P<0.05，表2)。vimentin在NSCLC细胞组、活检组中的阳性率分别为56.41%(22/39)、63.64%(21/33)，均显著高于NSCLC癌旁组织组(17.15%，7/35)(P<0.05，表2)。另在获取病例进行肺癌组织学分型鉴别诊断时，TTF-1等抗体阳性为肺腺癌，CK5/6等抗体阳性为肺鳞癌(图1)。

2.3 E-cadherin、N-cadherin、β-catentin及vimentin在NSCLC胸水细胞中的表达及与临床病理特征的关系E-cadherin的阳性率在低分化组为6.67%(1/15)，显著低于中+高分化组(41.67%，10/24)(P<0.05，表3)；在有淋巴结转移组阳性率为13.04%(3/23)，显著低于无淋巴结转移组(50.00%，8/16)(P<0.05，表3)；N-cadherin在有淋巴结转移组中的阳性率为69.57%(16/23)，显著高于无淋巴结转移组(31.25%，5/16)(P<0.05，表3)。β-catentin的异常阳性率在低分化组为100.00%(15/15)，显著高于中+高分化组(66.67%，16/24)(P<0.05，表4)；vimentin在无淋巴结转移组为31.25%(5/16)，显著低于有淋巴结转移组(73.91%，17/23)(P<0.05，表4)。以上4个抗体表达均与患者年龄、性别、吸烟史和组织学类型无关。

表1 E-cadherin、N-cadherin在NSCLC细胞组、活检组及癌旁组织组中的表达

a.NSCLC细胞组与NSCLC活检组相比；b.NSCLC活检组与NSCLC癌旁组织组相比；c.NSCLC细胞组与NSCLC癌旁组织组相比

表2 β-catentin及vimentin在NSCLC细胞组、活检组及癌旁组织组中的表达

a.NSCLC细胞组与NSCLC活检组相比；b.NSCLC活检组与NSCLC癌旁组织组相比；c.NSCLC细胞组与NSCLC癌旁组织组相比

ABCDEFGH图1 NSCLC病理学与EMT相关标志物的表达:A.NSCLC胸水TCT,巴氏染色;B.NSCLC胸水沉渣包埋组织HE染色;C.E-cadherin在NSCLC胸水细胞中阳性,SP法;D.N-cadherin在NSCLC胸水细胞中阳性,SP法;E.β-catentin在NSCLC胸水细胞中阳性,SP法;F.vimentin在NSCLC胸水细胞中阳性,SP法;G.TTF-1在NSCLC胸水细胞中阳性,SP法;H.CK5/6在NSCLC胸水细胞中阳性,SP法

3 讨论

目前，肺癌已成为全球癌症相关死亡的主要原因，其中约85%的确诊病例是NSCLC[5]。EMT是细胞从上皮向间质表型发生、发育转变的过程，该过程与胚胎形态发生有关，也与癌症的进展和转移有关[6]，以其发生的特定生物学环境为依据将其分为三型[7]：1型，EMT主要通过间充质细胞上皮化过程产生次级上皮细胞，实现胚胎形成过程中的细胞类型多样化；2型，通过产生纤维细胞以修复由创伤和炎症反应造成的组织损伤；3型，原发性上皮组织肿瘤细胞形成具有迁移能力的间充质细胞，随血流转移至不同部位，进而形成上皮细胞的肿瘤转移灶，该型EMT在肿瘤迁移和侵袭过程中是极其重要的一步，也是近年研究的热点，其在形态上主要表现为上皮细胞失去分化特征，细胞间连接消失，细胞骨架重建，细胞失去极性，黏附力下降，进而获得较强的侵袭和转移能力，同时获得了间质细胞特征，细胞形态由多边形转变为梭形的纤维细胞样形态[8]。这些变化通过相关分子标志物的表达改变而显现出来。

由于NSCLC早期临床症状不明显，发现时多已处于中晚期，此时患者也多已发生转移，转移是发生在一系列不连续或相对独立的步骤中，包括侵袭、血管生成、淋巴血管空间渗透和继发肿瘤的建立。MPE是肿瘤转移的一种类型，对NSCLC患者通常是一种预后不良的征象[9-10]，其潜在机制比其他类型转移引起的关注要少，在既往组织学研究中，与所有其它实体肿瘤一样，NSCLC的发生和转移也可以由EMT过程来阐述[11-12]，临床上最常用的检查样本是来自肿瘤组织的活检样本，是通过闭合胸膜活检或胸腔镜肺活检获得，这些方法均意味着侵入性手术和潜在的高风险，相较于活检标本，胸腔积液的取样较容易、创伤性小且可重复，因此，有必要进一步试验确定其能否作为组织替代物应用到肿瘤的预防与治疗研究中去[13]。本实验从细胞学入手，对比NSCLC细胞组与NSCLC活检组各抗体的阳性率之间差异有无统计学意义，这提示通过沉渣包埋MPE中脱落细胞EMT各标志物的阳性结果表达同活检组织学一样，即表现为E-cadherin等上皮标志物表达降低或缺失，N-cadherin、vimentin等间叶细胞标志物阳性[14]，同时黏附蛋白的辅助分子β-catentin的入核，即异常阳性率增高(NSCLC细胞组、NSCLC活检组各抗体阳性率均与NSCLC癌旁组比较)。这些均说明应用MPE细胞学检测结果与活检组织检测结果一致，既EMT在NSCLC的转移和侵袭中发挥重要作用，因此，通过进一步的研究和优化，使MPE细胞作为肿瘤活检组织的有效替代物，进而让我们更好的理解EMT过程中肿瘤细胞的异质性和恶性生物学行为，同时为新的靶向治疗药物的研究提供新思路和新方向，以便进行更可靠、有临床意义的肿瘤诊断和治疗，将是NSCLC肿瘤学研究的新突破口。