甲状腺乳头状癌中TROP-2表达的临床意义及其诊断价值

章萍萍，黄 悦，黄文斌，王劲松，吕 倩，赵有财

甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)是最常见的恶性甲状腺肿瘤，占甲状腺恶性肿瘤的70%以上[1]。典型的PTC根据毛玻璃样细胞核、核沟、核内包涵体以及砂砾体等特征，常规HE染色即可诊断，然而，对于滤泡亚型和微小亚型乳头状癌，易误诊为滤泡性肿瘤或因体积小而漏诊。具有乳头样核特征的非浸润性甲状腺滤泡性肿瘤(non-invasive follicular thyroid neoplasms with papillary-like nuclear features, NIFTP)是2017版甲状腺肿瘤WHO分类中提出的一种交界性肿瘤，因形态学类似于乳头状癌而被误诊为滤泡亚型乳头状癌[2]。近年来一些免疫组化标志物如Galectin-3、CK19、HBME-1和CD56可有助于PTC的诊断，但其敏感性和特异性均不理想，因此需要更好的免疫标志物来协助诊断PTC[3-4]。人类滋养层细胞表面抗原2(Human trophoblast cell-surface marker，TROP-2)又称肿瘤相关钙信号转导蛋白2(tumor-associated calcium signal transducer-2)，研究发现TROP-2过表达与人类肿瘤的侵袭性和不良预后有关[5-8]。TROP-2在PTC中表达的临床意义及其诊断价值国外已有一些文献报道，但结果不甚一致，而国内少有文献报道。本文采用免疫组化EnVision法检测TROP-2在各种甲状腺良恶性病变中的表达，同时分析TROP-2表达与PTC临床病理特征及BRAF V600E基因突变之间的关系，探讨其在PTC表达的临床意义以及诊断中的价值。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2015～2018年南京市第一医院病理科存档的甲状腺手术切除标本150例，患者年龄35～76岁，中位年龄47岁，其中男性54例，女性96例。150例中，恶性肿瘤100例(乳头状癌75例、滤泡性癌10例、髓样癌10例、差分化癌5例)，良性病变45例(正常甲状腺10例、结节性甲状腺肿10例、桥本甲状腺炎15例、滤泡性腺瘤10例)，NIFTP 5例。所有病例均由两位副主任医师复习切片并确诊。

1.2 方法

1.2.1免疫组化 标本均经10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片。免疫组化染色采用EnVision法，石蜡切片常规脱蜡、水化后，经高温高压抗原修复(10%柠檬酸盐抗原修复缓冲液，pH 6.0)；滴加100 μL一抗(羊抗人TROP-2多克隆抗体，购自北京中杉金桥公司)，4 ℃过夜；滴加100 μL经HRP标记的二抗；冲洗后DAB显色；苏木精复染后中性树胶封固。

1.2.2BRAF V600E基因突变检测 刮取1～5片福尔马林固定石蜡包埋组织(Formaldehyde fixation paraffin embedded tissue, FFPET)样品至1.5 mL离心管中，加入1 mL二甲苯震荡混匀10 s，然后室温离心去除上清，加入1 mL无水乙醇，离心和去除上清。核酸提取试剂盒和人BRAF V600E基因突变检测试剂盒均为艾德公司产品，具体操作按照试剂盒说明书进行，PCR反应在罗氏Cobas Z 480 PCR仪上进行。

1.3 结果判断TROP-2阳性定位于细胞膜。TROP-2阳性仅评估阳性细胞占整个组织的百分比，而不评比染色强度。为确定TROP-2表达对PTC的诊断价值，根据文献[9]将TROP-2的阳性设定为>10%作为诊断PTC的最佳阈值。

1.4 统计学分析采用SPSS 23.0软件进行统计学分析，TROP-2表达与PTC临床病理特征及BRAF V600E突变之间的关系采用χ2检验及Fisher精确概率法。

2 结果

2.1 TROP-2在甲状腺良恶性病变中的表达TROP-2在PTC中的阳性率为81.3%(61/75)，且大多数病例表现为强烈的膜阳性，而在甲状腺滤泡性癌、髓样癌和差分化癌中均阴性(图1A、B)。在PTC中，TROP-2表达在微小型PTC、术中冷冻剩余PTC以及PTC在周围甲状腺组织中的扩散非常明显(图2A～C)。TROP-2在所有良性甲状腺病变以及5例NIFTP中均阴性(图3)。TROP-2对PTC诊断的敏感性为81.3%，特异性为100%。

2.2 TROP-2表达与PTC临床病理特征的关系PTC中TROP-2表达与淋巴结转移呈正相关(P<0.05)，与患者年龄、性别、部位和临床分期均无关(P>0.05)。TROP-2表达亦与PTC的组织学类型有关，经典型PTC中TROP-2表达明显高于滤泡亚型PTC(P<0.05，表1)。

2.3 TROP-2表达与PTC中BRAF V600E基因突变之间的关系75例PTC中，BRAF V600E基因突变者63例，BRAF V600E基因突变率为84.0%。61例TROP-2阳性者中，54例BRAF V600E发生基因突变，14例TROP-2阴性者，BRAF V600E基因突变9例，相关性分析显示，TROP-2表达与PTC BRAF V600E基因突变呈正相关(P=0.041)。

图1A.经典型PTC中TROP-2阳性，EnVision法；B.滤泡亚型PTC中TROP-2阳性，EnVision法图2A.微小型PTC中TROP-2阳性，EnVision法；B.术中冷冻剩余PTC组织中TROP-2阳性，EnVision法；C.PTC周围甲状腺组织中扩散的乳头状癌成分TROP-2阳性，EnVision法图3NIFTP中TROP-2阴性，EnVision法

表1 TROP-2表达与PTC临床病理特征之间的关系

3 讨论

在甲状腺肿瘤的诊断中，根据典型的细胞形态和组织结构通常能够明确诊断，但是在有些病变中如滤泡性肿瘤和PTC滤泡亚型之间，单从组织形态学上诊断难度较大。甚至对于有些复杂病例，病理学专家也不能给出明确的诊断和鉴别[9-10]。虽然目前已经提出的一些免疫标志物如CK19、Galectin-3、HBME-1用于甲状腺肿瘤的诊断和鉴别诊断，但三者均无特异性，因为这些抗体均可以在甲状腺良性病变中表达。实际工作中多数是各种抗体的联合应用来提高诊断的可靠性[11]。TROP-2是一种最初在人胎盘滋养层组织中鉴定出的I型跨膜糖蛋白[12]。近来研究发现其在正常组织中低表达甚至不表达，功能上发挥着致癌基因的作用，而在肿瘤组织中TROP-2却有过表达现象，包括胶质瘤、乳腺癌、子宫颈癌、结直肠癌、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌等[5,13-14]。Finley等[15]采用聚类分析和基因测序法对14例PTC和21例甲状腺良性肿瘤进行研究，发现PTC相比较甲状腺良性肿瘤具有明显的异常基因表达，而TROP-2经测序分析被证实在PTC中过表达。Liu等[16]分析136例甲状腺肿瘤组织微阵列芯片中TROP-2的表达，同时对于其中的61例非典型甲状腺滤泡性病变也进行了Galectin-3、CK19及HBME-1的表达检测，研究结果表明，在PTC和良性病变中TROP-2的表达差异有统计学意义。Bychkov等[17]分析了226例甲状腺肿瘤和207例对照组中TROP-2的表达，结果发现所有乳头状微小癌、经典型PTC和高细胞亚型PTC中TROP-2呈弥漫阳性，而滤泡亚型PTC仅52.6%阳性且仅局灶阳性，TROP-2对于PTC诊断的敏感性为98.1%，特异性为97.5%，同时该研究亦发现TROP-2阳性>10%支持PTC的诊断。然而，Murtezaoglu等[18]研究发现TROP-2虽然在PTC中的表达高于良性甲状腺病变，但TROP-2对PTC诊断的敏感性和特异性低于HBME-1和CK19。导致结果不一致性的原因主要是由于使用的TROP-2克隆号以及其阳性阈值。甲状腺细胞学标本中TROP-2的免疫组化检测对PTC的诊断也具有潜在的临床价值[19]。本实验采用文献推荐的10%作为阳性阈值，结果发现TROP-2在81.3%PTC中阳性，而在所有其他甲状腺恶性肿瘤以及良性病变中均阴性，提示TROP-2是一种诊断PTC的高度特异性和敏感性的标志物，临床病理工作中可与目前常规使用的CK19、HBME-1、Galectin-3和CD56联合检测，提高PTC的诊断准确性。NIFTP是WHO(2017)甲状腺肿瘤分类中新提出的一种甲状腺交界性肿瘤，由于具有PTC的核特征而易误诊为PTC，从而导致患者不必要的颈部淋巴结清扫。本组5例NIFTP中TROP-2均阴性，提示TROP-2可能有助于NIFTP与滤泡亚型PTC的鉴别诊断，由于本组例数较少，尚需加大样本量进一步进行研究。

TROP-2作为一种肿瘤致癌基因，研究发现其在多种恶性肿瘤如喉癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌和胆囊癌等中过表达，而且TROP-2过表达是各种恶性肿瘤的不良预后因子[5]。本组实验结果发现，PTC中TROP-2表达与淋巴结转移密切相关，与患者年龄、性别、临床分期无关，本组实验结果与文献报道基本符合[17,20]。本实验结果亦发现，TROP-2在经典型PTC中的表达高于滤泡亚型PTC，而TROP-2可活化ERK1/2通路，在MAPK依赖性甲状腺癌发生中可能具有一定的作用[17]，因而推测TROP-2在不同亚型PTC中表达不同可能涉及到这些亚型PTC的发生机制不同。BRAF V600E基因作为PTC一种最重要的分子遗传学事件，研究证明BRAF V600E基因突变的PTC具有较高的侵袭性和较差的预后[21]。Bychkov等[17]和Kong等[20]研究发现PTC中TROP-2表达与BRAF V600E基因突变有关，本组实验结果亦显示，PTC中TROP-2表达与BRAF V600E基因突变呈正相关，这些研究提示TROP-2可能通过直接或间接诱导ERK通路活化，从而影响肿瘤进展或临床结局，但需要从细胞学或分子水平上进一步研究。

临床病理诊断中，甲状腺冷冻剩余标本中的PTC形态学变化，微小型PTC有时仅有数个滤泡改变，PTC的甲状腺内扩散均可能在日常工作中发生误诊、漏诊或报告不足，从而影响临床医师的处理。本实验中观察到TROP-2在这些情况下呈弥漫强阳性，非常有助于PTC的诊断和扩散病灶的识别，提示当出现石蜡切片病理诊断与快速诊断不一致、怀疑微小癌或甲状腺内扩散时可使用TROP-2免疫组化检测来提高PTC的检出率，从而有助于临床的正确处理。

总之，TROP-2是诊断PTC的一种高度特异性和敏感性的免疫标志物，日常工作中与CK19、HBME-1、CD56等联合检测不仅有助于PTC的诊断，而且可预测PTC患者的临床生物学行为和BRAF V600E基因突变状态。在组织变形、微小癌及PTC甲状腺扩散的诊断和鉴别诊断中TROP-2也具有较高的应用价值。