利用SPDE-MAL-DI-TOF-MS快速筛查生物样品中的百草枯和敌草快

高原

（中国刑事警察学院 辽宁沈阳 110854）

百草枯和敌草快是除草效果很好的吡啶鎓离子类除草剂，但是随着百草枯中毒案件的增多，敌草快逐步登上市场。部分厂商在敌草快中加入百草枯制成混合制剂，因此两者混合导致的中毒案件增加[1]。

百草枯和敌草快的分析主要通过气相色谱质谱分析[2][3][4][5]、毛细管电泳[6][7]、液相色谱[8][9][10][11]和液相色谱质谱分析[12][13][14][15][16][17][18]等方法来进行。这些方法虽然能够准确地对百草枯与敌草快进行定性定量分析，但是对于两者的混合制剂的检验需要优化色谱条件来达到组分的分离，同时需要调节色谱参数分析低含量组分，增加了分析的时间。而案件现场检材种类繁多、案件复杂多样，同时基层单位委托检验时并无明确的目标、案件侦破需要快速性与准确性。这就要求尽可能地减少分析时间、无需分离直接分析混合物来达到快速筛查检验百草枯与敌草快的目的。通过添加氢氧化钠和亚硫酸氢钠进行的显色试验多被作为简单判断是否含有百草枯和敌草快的方法。但是，由于生物样品中含有各种混杂物，检验者必须用固相萃取小柱进行预处理。传统的固相萃取法耗时长。此外，能够通过目视确认百草枯存在的浓度是1μg/mL左右，敌草快浓度是3μg/mL左右，因此显色试验仅适用于浓度比较高的情况。

固相分散萃取法（SPDE）作为固相萃取法的一种，萃取时间短、可以同时处理多个受检样品，因此该方法可以快速筛查生物样品中的农药。将固相分散萃取法应用到生物样品中的安眠药和危险毒品分析的案例见诸报告[19][20]，却未见用于萃取生物样品中百草枯与敌草快的文献报道。

基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法（MALDI-TOF-MS）可以直接用于混合物的分析。其具有灵敏度高、准确度高、分辨率高等特点，可以检测出浓度很低的目标物，同时其具备获取质量精确且检测时间极短的优点。用MALDI-TOF-MS进行的人尿、血液、组织的药品毒品分析可在一些报告[21][22][23][24][25][26][27][28][29]中找到，但没有发现适用于PQ和DQ检测的报告。

另外，理想情况下，应将犯罪鉴定过程中的检材的消耗限定在最小必要限度内，以备再鉴定使用，样品使用量应尽可能少。

因此，本实验针对相对少量的生物样品（全血、血清和尿液）中的百草枯和敌草快，将极少量的基质溶液用于固相分散萃取法中的洗脱液，并将该洗脱液直接供给MALDI-TOF-MS进行快速检验筛查，具有独特性。

一、实验部分

（一）实验试剂

百草枯二氯化物、敌草快二溴水合物、α-氰基-羟基肉桂酸(CHCA)、2，5-二羟基苯甲酸(DHB)（安谱公司），乙腈（天津市富宇精细化工有限公司），0.2%三氟乙酸水溶液（美国Fisher公司），甲醇（色谱纯，山东禹王实业有限公司化工分公司），全血、人尿、人血清（Sigma-Aldrich公司），超纯水（杭州娃哈哈集团），固相萃取剂Oasis®MCX(30μm)（北京金欧亚科技发展有限公司）。

（二）实验仪器

分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司），微型旋涡混合仪（上海泸西分析仪器厂有限公司），高速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司），电热鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司），微量恒温仪（北京美华仪科技有限公司），ultrafleXtremeTMMALDI-TOF-MS系统（北京东迅天地医疗仪器有限公司），KQ-200VDE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），SmartbeamTMII激光器（北京东迅天地医疗仪器有限公司），MTP 384靶板磨光钢（北京东迅天地医疗仪器有限公司），Waters Oasis MCX固相萃取柱（北京金欧亚科技发展有限公司）。

（二）实验流程

1.样品的制备。将PQ二氯化物和DQ二溴水合物在105℃下干燥2小时后，称取13.8mg的PQ二氯化物和18.7mg的DQ二溴水合物，分别溶解在100 mL超纯水中，制备PQ和DQ的标准溶液（各100μg/mL）。将其适量添加到人全血、人血清和人尿中，制备出实验所需浓度的样品。

2.固相悬浊液的制备。在Oasis®MCX填充小柱(150mg/6cc)中依次通入6mL的甲醇、6mL的超纯水，清洗固相后，在小柱中通入氮气将残留的甲醇蒸馏去除，使固相干燥。之后取下小柱盖，取固相100mg，加入10mL的超纯水，制备出10mg/mL的固相悬浮液。

3.基质溶液的制备。称取20mg的CHCA，加入1mL的0.2%三氟乙酸水溶液/乙腈混合液(1:1，v/v)，进行超声处理（5分钟），通过离心分离使溶解残留的CHCA沉淀，取上清液作为基质溶液。

4.样品预处理、SPDE萃取。（1）去蛋白处理。将0.1mL的全血样品或血清样品采集到1.5mL容量的塑料微管中，用0.1mL的超纯水稀释后，加入0.4mL的乙腈，用漩涡混合器搅拌1分钟，进行离心分离(10000rpm/min)，取0.5mL上清液进行SPDE。（2）SPDE萃取PQ与DQ。①从全血样品和血清样品中萃取。将上述“（1）”步骤中获取的0.5mL的全血样品或血清样品的去蛋白液倒入1.5mL容量的塑料微管内，加入0.9mL的超纯水和0.1mL的固相悬浊液，用漩涡混合器搅拌(30s)后进行离心分离(10000rpm/30s)，去除上清液。在底部残留的固相中加入1mL的超纯水，搅拌(10s)清洗后进行离心分离，去除上清液。接着加入1mL的甲醇，反复进行同样操作。通过在微量恒温仪(60℃)上加热微管，将残留的微量甲醇蒸馏去除。在该干燥固相中加入8μL的基质溶液，通过超声处理(1min)洗脱后进行离心分离(10000rpm/30s)，取0.5mL的萃取液涂到靶板上。②从尿样中萃取。将尿样进行离心分离后取0.1mL的上清液倒入1.5mL容量的塑料微管内，加入1.3mL的超纯水稀释后，加入0.1mL的固相悬浊液，用漩涡混合器搅拌(30s)后进行离心分离(10000rpm/30s)，去除上清液。后续的清洗和洗脱的方法与上述“①”步骤的方法相同。

5.基质辅助激光解吸电离—飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)分析。将上述“4.（2）”步骤获得的萃取液进行分析，仪器条件如下：激光器重复频率：1000Hz；激光冲击次数：500次；MS校准：m/z 190.0498(CHCA，[M+H]+)和m/z 172.0393(CHCA，[M-H2O+H]+)；质量误差：6.4ppm(PQ)、8.1ppm(DQ)；激光输出功率：50%；检测模式：正离子反射模式(m/z 0-300)；质量分辨率：M+·:2000～4000(PQ和DQ)；样品量：0.5μL。

二、结果与讨论

（一）关于预处理的讨论

1.全血样品和血清样品的去蛋白处理。对于全血样品和血清样品，由于其含有离心分离难以完全去除的成分，因此SPDE之前必须进行去蛋白处理。本实验比较了甲醇、乙醇和乙腈三种试剂去蛋白处理的效果。。血清样品中，用该3种有机剂没有发现明显差异。但是用乙醇对全血样品进行去蛋白处理时发现，在去蛋白液中加入超纯水时有浑浊现象产生，其与固相一起沉淀，因此乙醇不能用于去蛋白处理。用甲醇时，血红素蛋白质不能被彻底去除且上清液去除蛋白后呈淡红色。此后，用SPDE萃取后进行检测时发现，与乙腈相比这种情况下的PQ和DQ的检测强度偏低。因为残留的血红素蛋白质干扰了PQ和DQ的萃取。综上，本实验采用了乙腈进行去蛋白处理。

2.固相分散萃取法（SPDE）。百草枯和敌草快都是阳离子化合物，因此本实验采用了Oasis®MCX进行快速预处理。用Oasis®MCX量取0.5mg、1mg、2mg固相进行研究时发现，PQ和DQ的检测强度关系为0.5mg＜1mg≒2mg。但固相用量为2mg时，洗脱时的上清液比率低且采集困难，所以固相用量采用了1mg。同时，采用固相用量1mg时，将粒子直径为30μm和60μm的Oasis®MCX进行对比，没有发现差异。为了节省材料，在本实验中采用了粒子直径为30μm的Oasis®MCX。

与传统的SPE技术比较，SPDE可以任意调整固相用量，需要的洗脱液减少；可以通过搅拌、离心等简单操作完成留存和清洗步骤，浓缩所需时间短。在本实验中，由于使用的基质溶液是酸性的，因此将极少量（8μL）溶液用作洗脱液以便省略一般必要的浓缩过程，进一步缩短了萃取时间。综上，本次建立的以PQ和DQ为目标的SPDE可作为快速筛查的萃取法使用。

（二）基质辅助激光解吸电离—飞行时间质谱法（MALDI-TOF-MS）

1.基质的类型和浓度。当今在MALDI-TOF-MS中广泛使用的基质溶液是α-羟基氰基肉桂酸（CHCA）和2，5二羟基苯甲酸（DHB）。本实验配制了上述两种基质溶液（配制方法见实验流程“3.”），并分别添加PQ和DQ标准溶液（最终0.2μg/mL）后涂抹在靶板上进行检测。实验结果表明：两者都能检测到百草枯和敌草快。但在DHB条件下，靶板上形成了不均匀的针状晶体，并且百草枯和敌草快的检测强度会随着激光照射位置的不同而变化很大，还有些位置没有被检测到。因此，DHB条件下判断PQ和DQ的是否存在耗时且不准确，不予采用。相反，在CHCA条件下形成了比较均匀的薄膜，并且百草枯和敌草快的检测强度随着激光照射位置的不同几乎没有变化。综上，采用CHCA作为基质。图1表示的是将基质溶液涂抹到靶板的状态。

图1 DHB（左）与CHCA（右）作为基质溶液应用在靶板上的光学影像

2.质谱法。在基质溶液中添加PQ和DQ标准溶液（最终0.2μg/mL）并进行检测。结果表明：在百草枯（M+·精确质量值是186.1157）中明显检测出自由基正离子M+·(m/z 186.11)（图2），在敌草快（M+·精确质量值是184.1000）中明显检测出自由基正离子M+·(m/z 184.10)以及去质子化离子[M-H]+(m/z 183.10)（图3）。同时，也能检测出两者混合质谱（图4）。因此，可以根据M+·的检测结果判断是否含有百草枯，根据M+·和[M-H]+的检测结果判断是否含有敌草快。

图2 含有0.2μg/mLPQ的基质溶液的MALDI-TOF质谱图

图3 含有0.2μg/mLDQ的基质溶液的MALDI-TOF质谱图

图4 含有0.2μg/mLPQ与DQ混合制剂的基质溶液的MALDI-TOF质谱图

（三）优化条件下的各样品的检测和检出限

根据优化条件对各样品（PQ和DQ添加浓度：0μg/mL（空）、0.05μg/mL、0.5μg/mL、5μg/mL）进行萃取、检测，结果表明：浓度为0的全血、血清以及尿液中未检出百草枯和敌草快，而在其他添加浓度的样品中百草枯和敌草快均被检出。低浓度（0.05μg/mL）的样品，也能通过足够的S/N被检测出来（图5、6和7）。同时，在计算该条件下的质量分辨率（半峰宽法）时，发现百草枯和敌草快的M+·约为2000～4000。以m/z 186.11（百草枯，M+·）和m/z 183.10（敌草快，[M-H]+）为基准计算检测限（S/N＞3）时，发现所有样品的PQ为0.002μg/mL，DQ为0.01μg/mL。

图5 空白全血（上）与PQ和DQ混合制剂添加浓度为0.05μg/mL的全血样品（下）的MALDI-TOF质谱图

图6 空白血清（上）与PQ和DQ混合制剂添加浓度为0.05μg/mL的血清样品（下）的MALDI-TOF质谱图

图7 含有不同PQ与DQ混合制剂浓度的尿液样品的MALDI-TOF质谱图（空白（左上），0.05μg/mL（右上），0.5μg/mL（左下），5μg/mL（右下））

对于添加浓度为0的全血、血清和尿液，我们将含有百草枯和敌草快(各0.2μg/mL)的基质溶液用作洗脱液进行萃取，对得到的萃取物进行了检测。将此时的百草枯和敌草快的检测强度与采用的基质溶液自身受检时的检测强度进行了对比，发现基本无差异。因此可以认为生物样品和固相几乎没有引发基质效应。

在毒物毒品分析领域，有些药物因其质量数和百草枯或敌草快一样，可能会干扰到对百草枯或敌草快存在与否的判断。例如，芽子碱（M+H的精确质量计算值为186.1124）、氯代麻黄碱、氯代甲基苯丙胺以及氯苯吡胺（M+H的精确质量计算值均为184.0887），在该条件下，很难通过质量分辨率（约2000～4000）识别百草枯和敌草快。因此，对于该方法下可能存在百草枯和敌草快的样品，必须通过LC-MS进行检查才能做出最终判断。

与传统显色试验相比，本项研究中建立的利用MALDI-TOF-MS检测PQ和DQ的方法虽然复杂一点，但在获取用以判断百草枯和敌草快是否存在的质量信息和检测灵敏度方面表现优异。因此，该方法可以在药品毒品分析中作为PQ枯和DQ的快速检验筛查的方法使用。

三、结论

本实验的目的是采用MALDI-TOF-MS检测相对少量（0.1mL）的生物样品（全血、血清和尿液）中是否存在百草枯和敌草快。通过对全血样品和血清样品用乙腈去除蛋白，对尿液进行离心分离。使用Oasis®MCX进行SPDE，将基质溶液用作洗脱液并直接对洗脱液进行MALDI-TOF-MS分析。实验发现：（1）与显色试验这种传统检测方法相比，利用MALDI-TOF-MS检测百草枯和敌草快的方法虽然复杂一些，但它可以获取质量信息，进一步提高检测敏感度（百草枯提高可以200倍，敌草快可以提高150倍）。实验结果表明即使在轻度中毒程度的低浓度（0.05μg/mL）样品中也能很好地检测出百草枯和敌草快。（2）SPDE操作弥补了传统固相萃取法洗脱时间长的缺陷。其可以实现快速萃取样品、同时处理多个受检样品，并且固相用量非常少（1 mg），所以可以降低成本。（3）与使用仪器分析的传统方法[2][3][4][5][6][7][8][9][10][11][12][13][14][15][16][17][18]相比，虽然无法通过色谱或电泳将目标物与混杂物分离，但本方法准确度高，可以直接对混合物进行分析，单个受检样品的检测所需时间（包括靶板样品涂抹时间和设备导入时间）很短，所以本方法在多样品条件下具有优势。

综上，本方法可以在农药毒物分析中作为百草枯和敌草快的快速检验筛查方法使用。