脂氧素受体激动剂BML-111对大鼠急性肝损伤的干预作用及其机制*

胡泉东， 杨玉娟， 余珊珊

((1. 绍兴职业技术学院， 绍兴 312000； 2. 南昌大学基础医学院病理生理学教研室， 南昌 330006； 3. 中国科学院大学遗传与发育生物学研究所， 北京 100101)

脂氧素(lipoxin, LXs)是重要的内源性脂质抗炎递质，被称作炎症的“刹车”信号。它由脂加氧酶(lipoxygenase)催化花生四烯酸而成，能发挥广泛的抗炎促炎症消退作用[1]。但由于其半衰期短，易降解等特点，使得其很难应用于动物实验。而其受体激动剂BML-111(5(S),6(R),-trihydroxyheptanoic acid methylester)具有与甲酰肽受体2(formyl peptidereceptor 2, FPR2，为主要的脂氧素作用受体)一致的特点，且性质稳定，商业化易获得，故广泛应用于动物实验研究中[2]。已有研究证实，BML-111在多种疾病中都发挥保护作用[2-6]。课题组前期研究已经证实了BML-111对LPS/D-GalN诱导的急性肝损伤具有保护作用[6]。RAAS相关成分的含量在肝脏发生损伤时，会发生明显变化[7]，而且ACE、Ang II浓度的增高与肝损伤程度呈现出一定的正相关[8]。研究表明Ang II促进肝纤维化与脂肪肝的进展[9-10]，而Ang- (1-7)抑制肝脏炎症反应[11]。肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosteronesystem, RAAS)在肝脏疾病的发生发展过程中具有重要作用。研究表明脂氧素对急性肝损伤具有保护作用，但具体机制尚待阐明。因此为了进一步明确脂氧素在大鼠急性肝损伤的保护机制，本研究利用CCL4诱导的大鼠急性肝损伤模型为研究对象[12]，首先观察脂氧素对急性肝损伤是否对急性肝损伤具有保护，然后通过检测各实验组相关RAAS含量的变化，观察脂氧素在发挥保护效应时是否通过调节RAAS而发挥对急性肝损伤的保护，期望为临床治疗急性肝损伤提供更多的切入点。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级SD大鼠40只，雌雄各半，购自南昌大学动物科学实验中心，体重(200 ±20) g。大鼠在适应条件下(温度(23±2)℃，湿度55%±10%)饲养，自由进食进饮。

1.2 主要试剂

BML-111购自美国Enzo Life Sciences公司，BOC-2购自GenScript公司，CCL4购自成都市科龙化工试剂厂，MPO、ALT、AST试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；Ang-(1-7)、ACE2 ELISA试剂盒购自上海西塘生物科技有限公司；ACE、Ang II ELISA试剂盒购自武汉云克隆科技股份有限公司。BCA蛋白定量试剂盒购自武汉博士德生物有限公司。β-actin抗体购自美国Abcam公司，Ang II抗体，Ang-(1-7)抗体购自美国Cloud-Clone Corp。

1.3 主要实验试剂配制

BML-111储存液：2.5 mg BML-111加入DMSO 0.25 ml混匀，超净台中操作，-20℃保存备用。

BML-111工作液：0.5 ml储存液加入4.5 ml PBS，现配现用。

BOC-2储存液：0.5 mg BOC-2加入0.25 ml DMSO和0.25 ml PBS混匀，超净台中操作，保存于 -20℃。(注：因DMSO对细胞有毒，所以在可以充分溶解的情况下尽量减少DMSO用量。)

BOC-2工作液：0.5 ml储存液加入9.5 ml PBS，现配现用。

40%CCL4橄榄油溶液：40 ml CCL4加入80 ml橄榄油， 超净台中操作，搅拌过夜。

1.4 大鼠分组及肝损伤模型的建立

将大鼠随机分为4组，每组6只，即正常对照组(CON)、肝损伤模型组(CCL4)、治疗组(BML-111)和阻断剂组(BOC-2)。正常对照组：皮下注射橄榄油，剂量1.8 ml/kg模型组：皮下注射40% CCL4油剂(橄榄油为溶剂)，剂量3 ml/kg。BML-111治疗组组：皮下注射Lipoxin受体激动剂BML-111，剂量1 mg/kg，30 min后处理同模型组。BOC-2阻断剂组组：皮下注射Lipoxin受体阻断剂BOC-2，剂量50 μg/kg，30 min后处理同BML-111组。

1.5 标本收集

血 清：各组大鼠造模24 h后用戊巴比妥钠麻醉，腹主静脉取血并收集血液约5 ml于离心管中，静置30 min，4 000 r/min离心20 min，小心吸取上层上清，放入-80℃冰箱备用。

肝组织：取出肝脏，冰PBS洗涤4次，于冰上切取大小约1.0×1.0×2.0 cm左右的组织块，迅速浸泡于10%甲醛中，分装约200 mg组织块若干于1.5 ml EP管中，连同剩余肝组织一起放入-80℃冰箱备用。

1.6 肝脏大体形态观察及HE染色

切取1.0×1.0×2.0 cm左右的组织块，浸泡于10%甲醛中。常规苏木素-伊红(HE)染色，光镜下观察肝组织形态学变化。

1.7 血清AST和ALT活性检测

收集以后的血清4℃、4 000 r/min离心20 min，留取上清。按照试剂盒说明书(南京建成生物工程研究所)步骤测定血清中丙氨酸转氨酶(alanine transaminase, ALT)和天冬氨酸转氨酶(aspartate transaminase,AST)的含量。

1.8 检测血清Ang II、ACE、Ang-(1-7)、ACE2含量

制备血清后，按说明书(武汉云克隆科技股份有限公司)要求进行ELISA检测血清Ang II、ACE、Ang-(1-7)、ACE2含量。

1.9 肝组织匀浆液的制备

准确称取100 mg肝组织，用冰PBS清洗三次。加入1 ml冰PBS，在匀浆器中研磨充分。-80℃速冻，42℃解冻，反复冻融两次。10 000 r/min，4℃离心15 min。取上清，-80℃保存或置于冰上继续后续实验。

1.10 髓过氧化物酶(MPO)活性检测

取离心上清液100 μl，按照试剂盒说明书(南京建成生物工程研究所)步骤测定血清中髓过氧化物酶(MPO)。

1.11 免疫蛋白印迹法检测组织Ang II、Ang-(1-7)蛋白表达

取肝组织匀浆液，进行蛋白浓度测定(BCA法)，定量。配制10%分离胶(10 ml)和5%浓缩胶(3 ml)。100℃煮待检测蛋白样品5 min，于冰上冷却10 min。先加入预染蛋白Marker 4 μl，然后按事先设定顺序加入蛋白样品各40 μg，以恒压60 V电泳30 min，然后恒压100 V电泳直至所需蛋白分离。然后蛋白经湿转、封闭和孵育第一抗体、辣根过氧化物酶标记的二抗工作液室温孵育1 h ；TBST清洗后用辣根过氧化物酶发光液，于Image Lab凝胶成像系统曝光，用Image-Pro Plus 6.0软件进行灰度分析。

1.12 统计学处理

2 结果

2.1 BML-111对CCL4诱导的大鼠急性肝脏损伤和炎症细胞浸润的影响

肝脏大体外观显示，CCL4组大鼠肝脏色泽变黄，肝组织呈颗粒状，表面可见片状瘀斑和多处出血点，质地稍硬； BML-111治疗的大鼠肝脏较CCL4组有明显的改善，质地颜色与CON组较接近；而BOC-2组肝脏可见散在瘀斑和出血点(图1A)。

光学显微镜下可见CCL4组大鼠肝脏小叶中心部明显坏死，坏死区域周围可见肝细胞水肿，炎性细胞浸润，脂肪变性。BML-111组肝细胞病变症状明显减轻，BOC-2组肝细胞水肿、变性及空泡样变，上述提示, BML-111抑制CCL4诱导急性肝损伤，减少炎症细胞浸润(图1B，图1见彩图页Ⅳ)。

2.2 BML-111对血清MPO及ALT/AST活性的影响

检测结果显示：与对照组相比，模型组大鼠肝脏MPO及ALT/AST活性明显升高(P<0.01)；与模型组对比，BML-111治疗组MPO及ALT/AST活性明显下降(P<0.01)。与BOC-2阻断剂组相比，BML-111治疗组MPO及ALT/AST活性明显下降(P< 0.01，表1)。

Tab. 1 Changes of MPO activity and serum ALT/AST in each n=6)

2.3 BML-111对血清ACE、Ang II、ACE2、Ang-(1-7)含量的影响

实验采用酶联免疫吸附法检测各组血清中ACE、Ang II、ACE2、Ang-(1-7)的含量。与对照组相比，模型组ACE、Ang II、ACE2、Ang-(1-7)含量明显升高(P<0.01)；与模型组对比，BML-111治疗组ACE、Ang II含量明显下降(P<0.01,P<0.05)，ACE2、Ang-(1-7)含量明显升高(P<0.01)；与BOC-2阻断剂组相比，BML-111治疗组ACE、Ang II含量下降(P<0.05)，ACE2、Ang-(1-7)明显升高(P< 0.01，P<0.05，表2)。

Tab. 2 Changes of ACE, Ang II, ACE2 and Ang-(1-7) in each group(ng/ml, n=6)

2.4 BML-111对肝组织中Ang-(1-7)、AngII含量的影响

肝组织中Ang-(1-7)、Ang II的蛋白表达水平通过Western-blot进行检测。结果显示： 与正常组对比，模型组Ang-(1-7) 、Ang II 含量明显升高；与模型组相比，BML-111治疗组Ang-(1-7) 含量明显升高，Ang II含量明显降低；与BOC-2阻断剂组对比，BML-111治疗组Ang-(1-7) 含量明显升高，Ang II含量明显下降(图2，表3)。

Fig. 2 The contents of Ang II and Ang(1-7) in liver tissue were assessed by Western blot

Tab. 3 Analysis of Ang II and Ang(1-7) in liver tissue in each n=5)

3 讨论

脂氧素是一种重要的脂质调节因子，在炎症反应过程中通过特殊G-蛋白偶联受体(ALX)，发挥抗炎以及促炎症消散作用[13]。而课题组前期实验结果表明脂氧素受体激动剂BML-111抑制LPS/D-GalN诱导炎症细胞的浸润，而且应用脂氧素受体阻断剂BOC-2对肝脏无直接损伤[6]。本实验在用CCL4诱导急性肝损伤时，发现血清中ALT,AST活性明显升高，而BML-111降低这些反应肝功能指标的酶活性。有实验研究表明非酒精性脂肪肝损伤中ALT、AST、IL-6、IL-17 水平明显升高[14]。在大鼠糖尿病性肝硬化损伤和纤维化发生中，AST和ALT显著升高，钙敏感受体(calcium-sensing receptor, CaSR)和胶原Ⅰ(COⅠ)、胶原Ⅲ(COⅢ)、基质金属蛋白酶1(MMP1)、基质金属蛋白酶2(MMP2)、基质金属蛋白酶9(MMP9)蛋白表达上调[15]。髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)是一种血红素蛋白，富含于中性粒细胞中，由粒细胞进入循环之前在骨髓内合成并存储于噬天青颗粒内。外界刺激可导致中性粒细胞聚集，从而释放髓过氧化物酶。有研究表明急性肺损伤时MPO活性增高，而BML-111在发挥急性肺损伤的保护作用时与降低MPO活性有关[16]。本实验模型组中MPO活性明显升高，而BML-111能够降低MPO活性。从实验结果来看BML-111能够抑制CCL4诱导急性肝损伤时的炎症细胞浸润，而且此结果与(图1B)HE染色结果一致。BML-111的抗急性损伤作用的确与降低MPO活性有关[6-7]。

肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosteronesystem, RAAS)的主要成分包括ACE、Ang II、ACE2、Ang-(1-7)；这些成分在体内广泛分部，主要存在于肝、肺等器官；当肝、肺受到损伤时，体内ACE、Ang II、ACE2、Ang-(1-7)含量发生变化[17-18]。本研究采用酶联免疫吸附法检测血清中ACE、Ang II、ACE2、Ang-(1-7)含量。结果显示ACE、Ang II在模型组中含量明显升高，而ACE2、Ang-(1-7)同样会升高。而BML-111治疗组在降低ACE、Ang II含量的同时还能够进一步升高ACE2、Ang-(1-7)含量。表明急性肝损伤时BML-111对ACE、 Ang II、ACE2、Ang-(1-7)进行了重新调整。有研究报道肝损伤程度与Ang II、ACE浓度正相关，应用ACE抑制剂明显减轻了CCL4诱导的氧化应激压力和炎症反应[19]。有研究表明敲除ACE2基因会导致肝细胞内的氧化压力和炎症损伤程度加重，造成肝损伤[20]。由此推测，模型组ACE2、Ang-(1-7)含量的升高可能是一种应激性的保护反应。

实验结果表明模型组中ACE、Ang II含量高于正常组，而BML-111能降低ACE、Ang II的表达，在一定程度上减轻炎症细胞的浸润，抑制炎症反应。有研究发现Ang II对肝损伤的机制可能与下调miR-590-5p表达，增加内质网的氧化应激压力有关，炎症细胞在Ang II诱导下，加速在肝损伤部位的浸润[21]，亦有研究表明抑制ACE合成，能够减轻炎症反应[22]。已有研究表明Ang-(1-7)在急性肺损伤时，含量升高，而且在加用Ang-(1-7)后有较好的抗急性肺损伤作用[23]。

本实验证实脂氧素受体激动剂BML-111具有一定的抗急性肝损伤作用，而且ACE、Ang II、ACE2、Ang-(1-7)含量在肝损伤时发生了变化。实验结果提示脂氧素受体激动剂BML-111可能通过调节ACE、Ang II、ACE2、Ang-(1-7)的含量发挥一定的抗急性肝损伤作用。