有氧运动对高糖高脂膳食大鼠腓肠肌Nrf2-SOD的影响*

刘玉倩， 张 静， 高丽娜， 王海涛△

((1. 岭南师范学院体育科学学院， 2. 运动与健康研究所， 广东 湛江 524048； 3. 河北师范大学体育学院， 河北 石家庄 050024)

胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)是指组织对胰岛素的敏感性下降，从而代偿性地引起胰岛素分泌增加。IR不仅是 2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus ,T2DM)的发病基础，也是高血压、糖代谢紊乱等多种代谢相关疾病共同的病理生理基础。2019年全球约4.63亿20～79岁成人患糖尿病，我国的糖尿病人数居世界首位1.164亿，90%以上为T2DM。此外，还有3.739亿人口存在糖耐量受损(IGT)[1]。因此，探讨IR的发病机制，有效防治IR不仅是目前健康中国背景下，我国医疗卫生领域亟待解决的问题，更是全球关注的热点。人体和动物实验均表明运动在IR防治中发挥重要作用[2-3]。近年研究表明核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)是调控IR病程中重要的保护因子[4]。Nrf2具有抗氧化和抗炎症作用，解耦联后的Nrf2转移进入细胞核内，通过与细胞核内的抗氧化反应元件(antioxidant response element, ARE)相结合从而激活在启动子区域包含ARE的相关基因的表达，包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽(glutathione, GSH)等，Nrf2/ARE通路可调控机体近200多种酶的活性。运动可激活Nrf2/ARE通路，促进下游抗氧化酶的表达[5]。骨骼肌是外周组织摄取葡萄糖的主要部位，因此骨骼肌发生的IR在糖代谢性疾病的发病中起到关键作用。本研究采用高糖高脂膳食喂养大鼠，在造模过程中同时进行运动，主要研究运动预防IR的作用机制。通过探讨有氧运动预防IR形成过程中腓肠肌Nrf2-SOD及其相关因子的变化，为运动预防IR提供实验和理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、分组及处理

选取24只12月龄清洁级健康雄性SD大鼠，在实验室适应性饲养1周，自然光照10～12 h，动物房内温度平均22℃～25℃，相对湿度为60% ± 5%。随机分为3组(n=8)：对照组(control，C)、高糖高脂IR组(insulin resistance model，IR)和高糖高脂IR并运动组(insulin resistance model and exercise，IRE)。对照组自然饮水摄食，不进行运动干预。在IR造模过程中进行运动干预。前期预实验用高糖高脂饲料喂养可成功复制胰岛素抵抗模型，成功率可达90%以上。经过6周的高糖高脂膳食，成功复制了大鼠IR模型。检测空腹FBG：(7.66±1.18)mmol/L，HOMA-IR：4.96±1.32, 显著高于对照组(P<0.01)。IRE组进行6周有氧运动；IR和IRE均采用高糖高脂饲料喂养，为实验室以往研究中的成熟配方，复制IR模型。其主要成分包含20%的蔗糖和10%的猪油，此外，添加8%的蛋黄粉和0.1%胆酸钠，其余61.9%为基础饲料(AIN-93G)[6]。运动总计6周，第1周进行适应性训练，从 5 m/min 递增到 15 m/min, 跑台坡度为5%(运动强度约为50%～60%VO2max)[7]。6 d/w，每天训练30 min。第2周每天训练30 min，此后每周递增5 min，第5～6 周 15 m/min，45 min[8]。大鼠停止运动后24 h(以消除急性运动的影响)，禁食12 h(以消除膳食对血糖的影响)后右心耳取血，室温静置 30 min，3 000 r/min，离心 15 min，取血清。剥离腓肠肌外侧头，取100 mg左右投入液氮保存，以备进行相关指标的测试。

1.2 主要试剂和仪器

主要试剂：葡萄糖转运蛋白(glucose transporters 4，GLUT4) 抗体(Abcam，USA)、Nrf2抗体(ImmunoWay, USA)。胰岛素ELISA试剂盒(南京建成)、8-羟基脱氧鸟苷 (8-hydroxy-2 deoxyguanosine，8-OHdG)ELISA试剂盒(R&D systems)；谷胱甘肽氧化还原(glutathione / L-Glutathione, Oxidized，GSH/GSSG)、超氧化物歧化酶 (total superoxide dismutase，T-SOD)、丙二醛(malonaldehyde，MDA)、过氧化氢酶 (catalase，CAT)、肌糖原试剂盒(南京建成)。

主要仪器：Synergy H4多功能酶标仪(Thermo scientific)，Fujifilm LAS-4000化学发光仪(FUJIFILM,日本)，Milli-Q纯水系统(Millipore, USA)，超声破碎仪(宁波新芝JY92-Ⅱ)，电泳和转膜系统(Bio-rad Criterion)，罗氏血糖仪。

1.3 指标测试

测空腹胰岛素(fasting insulin, INS)、空腹血糖(FBG)，用稳态模式评估法(homeostasis model assessment insulin resistance，HOMA-IR)评价IR，计算公式：HOMA-IR =空腹胰岛素(mU/L)×空腹血糖(mmol/L)/22.5。Western blot检测腓肠肌GLUT4(稀释度： 1∶2 000)和Nrf2(稀释度： 1∶500)的蛋白表达。检测SOD、MDA、 GSH/GSSG水平、CAT、肌糖原的含量，采用分光光度计比色法。ELISA法测定腓肠肌8-OHdG含量。先将腓肠肌制成10%组织匀浆，按试剂盒说明书进行检测。。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 有氧运动对大鼠血糖及IR的影响

IR组FBG和HOMA-IR 明显高于C组(P< 0.01)，说明高糖高脂膳食是血糖增加和胰岛素抵抗的重要原因。IRE组FBG和HOMA-IR 明显低于IR组(P<0.05)。IRE组肌糖原明显高于IR组(P< 0.01，表1)。

2.2 有氧运动对大鼠腓肠肌氧化应激和抗氧化酶活性的影响

IR组T-SOD、CAT、GSH/GSSG明显低于C组(P<0.01)，MDA明显高于C组(P<0.01)。 IRE组T-SOD和CAT、GSH/GSSG明显高于IR组(P< 0.01)；IRE组8-OHdG和MDA明显低于IR组(P< 0.01，表2)。

Tab. 1 Effects of aerobic exercise on the indexes of IR in each group n=8)

Tab. 2 Effects of aerobic exercise on the indexes of oxidative stress in each group n=8)

2.3 有氧运动对大鼠腓肠肌Nrf2和GLUT4蛋白表达的影响

IR组腓肠肌Nrf2和GLUT4明显低于C组 (P<0.05，P<0.01)。IRE组腓肠肌Nrf2和GLUT4明显高于IR组 (P<0.01，图2，表3)。在高糖高脂膳食情况下，运动能有效促进葡萄糖从血液循环系统向骨骼肌的转运，以达到降低血糖的目的。

Fig. 1 Effects of aerobic exercise on the expression of Nrf2 of gastrocnemius (relative to β-actin )

Fig. 2 Effects of aerobic exercise on the expression of GLUT4 of gastrocnemius (relative to β-actin )

Tab. 3 Effects of aerobic exercise on the expressions of Nrf2 and Nrf2 of gastrocnemius n=8)

3 讨论

高糖高脂是目前许多代谢性疾病的诱发因素，IR也是糖尿病、高血压、心脑血管疾病等许多病症的共同病理学基础[9]。运动对IR的影响机制是目前的研究热点。多年来运动作为IR的重要防治手段已广泛应用于临床，关于其作用机制的探讨引起许多学者的研究兴趣[10]。不同的运动方式对防治IR的作用机制存在差别。其中耐力训练可增加骨骼肌线粒体合成和增强抗氧化酶活性。在解释运动对IR调控机制中，关于运动对Nrf2/ARE的影响及Nrf2/ARE在疾病防治中的作用是运动医学的研究热点[11]。运动能够激活Nrf2/ARE信号通路，并且在小鼠心脏中发现Nrf2/ARE抗氧化通路防御能力会随着运动强度的增加而提高。运动通过Nrf2增加SOD表达，增强骨骼肌的抗氧化能力[12]。有氧运动对小鼠骨骼肌Nrf2与Keap1解离和Nrf2转位入核的影响与运动时间的长短有关。这些报道与本研究的结果是一致的。最新的研究表明有氧运动可以激活骨骼肌Nrf2，激活下游的抗氧化酶活性，miR3405p可能是运动影响Nrf2的上游调节因子[13]。运动对Nrf2的影响及其在抗氧化通路中的作用，及其与不同运动时间、运动类型的关系还需进一步研究。氧化还原失衡是许多代谢性疾病的共有基础，因此，本研究重点探讨了有氧运动在预防高糖高脂膳食诱发大鼠胰岛素抵抗过程中Nrf2及SOD、氧化应激的变化。

本实验采用的12月龄大鼠，在取材时处于 13.5月龄，接近人的中年阶段。此时正是机体各器官机能逐渐衰退，过氧化损伤增强，肌肉出现随年龄递增的衰减综合征。而运动是目前积极倡导的健康生活方式的重要组成部分，科学合理的运动成为预防疾病、促进健康的重要方法[14]。实验发现高糖高脂膳食明显增加成年大鼠的体重、空腹血糖和胰岛素，HOMA-IR显著高于对照组，导致IR发生。骨骼肌中Nrf2表达量下降，Nrf2/ARE通路受到抑制，导致下游抗氧化酶SOD活性下降，骨骼肌过氧化损伤严重，实验中8-OHdG增加，说明线粒体损伤加剧，脂质过氧化损伤明显(MDA增加)。肌细胞有氧氧化能力下降，GLUT4表达下降，肌细胞对血糖的摄取能力下降，因此出现高血糖、高胰岛素和IR，但骨骼肌中的糖原减少。这些结果表明大鼠IR造模成功，也说明高糖高脂膳食是诱发IR的重要原因。

在实验中IRE组的Nrf2蛋白表达增加，通过Nrf2信号通路促进下游的T-SOD、CAT和GSH/GSSG活性增强，减少了成年大鼠骨骼肌中随着年龄增长的氧化损伤，因此，以骨骼肌线粒体损伤为代表的标志物8-OHdG表达低于对照组。MDA是脂质过氧化的产物，在运动后骨骼肌中的含量也下降。这均表明有氧运动减轻了骨骼肌增龄性的过氧化损伤。在运动中骨骼肌细胞功能活跃，骨骼肌细胞膜上负责将血液中葡萄糖转运进入骨骼肌的GLUT4表达增强，因此，运动组血糖下降，但肌糖原含量增加。Ferrari等的研究也表明运动刺激GLUT4表达，改善IR，与本实验结果是一致的[15]。因为取材时间为运动后结束24 h，消除了急性运动的影响，所以大鼠肌糖原在运动后得到了恢复。本实验中大鼠运动时的跑台坡度为5%，相当于一定的抗阻运动，该运动对于延缓肌肉衰减有较好的作用。抗阻运动引起肌肉质量增加，本实验组前期研究表明该运动可增加成年大鼠腓肠肌横截面积[8]。

Nrf2/ARE通路是迄今为止发现的最为重要的内源性抗氧化应激通路。同时Nrf2/ARE 通路与IR、T2DM及其并发症的发生、发展联系密切，并有望成为极具前景的T2DM干预新靶标[16-17]。对高糖诱导的T2DM大鼠肝细胞系 (HepG2)的研究进一步证实，Nrf2/ARE通路在改善细胞氧化应激和胰岛素抵抗中发挥重要作用[18]。Nrf2主要通过ARE反应原件激活下游的抗氧化酶。还原型谷胱甘肽(GSH) 、SOD等均为含有ARE反应元件的酶，受Nrf2/ARE通路的调控。本实验中IRE组抗氧酶活性增强，这些激活的抗氧化酶有助于老年大鼠对抗高糖高脂引发的影响，如降低线粒体和脂质的过氧化损伤。骨骼肌细胞膜上的GLUT4表达增强，有助于将血糖转运至运动中功能活跃的组织器官，一方面降低血糖和胰岛素，另一方面增加肌肉中糖原储备，为后续运动所需，进一步改善IR。运动对高糖高脂大鼠腓肠肌细胞膜上的GLUT4影响明显，这也表明在有氧运动过程中机体积极调整糖的代谢过程，以缓冲高糖高脂膳食的影响，但这种缓冲也是有一定限度的，一旦超出机体的调整能力，依然会出现血糖增高。

综上所述，有氧运动可激活Nrf2-SOD通路，减少因高糖高脂诱发的过氧化损伤，促进骨骼肌对血糖的摄取，缓解血糖增加程度，预防IR和T2DM的发生。研究结果对运动预防IR提供理论依据。本研究中选用的实验样本为腓肠肌，主要以快肌为主，对于以慢肌为主的比目鱼肌等，运动对其糖代谢及不同运动形式(耐力、抗阻、高强度间歇等)防治IR的作用，还需要深入探讨[19-20]。