苍术素对大鼠心脏正性肌力的作用及其机制*

高 丽， 张文慧， 王羽维， 朱晓佳， 肖钰洁， 高倩雯， 李 伟， 陈 龙,3△

((1. 南京中医药大学药学院， 江苏 南京 210023； 2. 泰州市第四人民医院， 江苏 泰州 225300； 3. 泰州中国医药城中医药研究院， 江苏 泰州 225300)

苍术素(atractylodin)是中药苍术的主要成分之一，具有广泛的药理作用[1]。这些药理作用包括抗神经炎症反应[2]、改善急性肝衰竭[3]、抑制药物诱导的关节炎发生[4]、抗肿瘤[5]、通过促进平滑肌收缩调节胃肠道功能[6]等。

苍术素这种广泛的药理作用是由于其激素样作用，研究表明苍术素是葛瑞林(Ghrelin)信号通路的增效剂[7]。葛瑞林是机体内源性多肽，首次由日本学者在胃内分离发现，早期研究发现葛瑞林具有刺激脑内神经细胞分泌生长激素作用。因此，神经细胞上的葛瑞林作用靶点被称为生长激素促分泌受体(growth hormone secretagogue receptor)或葛瑞林受体(ghrelin receptor)，而较早发现的葛瑞林称为生长激素促分泌受体配体(endogenous ligand of growth hormone secretagogue receptor)[8]。进一步研究表明，心肌细胞也能合成并分泌葛瑞林[9,10]，且心肌细胞表达有生长激素促分泌受体[8]，葛瑞林具有保护心肌细胞免于心肌缺血[9,10]及增加心肌收缩力的作用[11]。而正性肌力作用的最明显的表征则是心肌收缩力上升以及心输出量增加等。

苍术素对心肌细胞直接的生物学作用研究也较为深入。日本汉方“三和六君子汤(rikkunshito)”能够改善心衰状态的小鼠心脏功能，具有抗心肌细胞钙化、抗心肌萎缩及降低交感神经张力作用[7]。而服用该方人体的血清中主要成分为苍术素[12]。此外，苍术素具有增加胞浆钙及cAMP浓度[7]、促进蛋白磷酸化作用[13]。

基于苍术素对葛瑞林(Ghrelin)信号通路的增效作用[7]、对胃肠道平滑肌的收缩力增强作用[6]及保护心肌细胞作用[7]，本研究首次采用在体、离体大鼠心脏实验阐明苍术素对心脏正性肌力的作用及其机制，为临床用其治疗心力衰竭提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

苍术素(Atractylodin)：购于四川成都乐美天/德思特生物，批号：DST190401-004，纯度大于99%；H89：PKA (Protein kinase A) 抑制剂及KN-93：CaMKII (Ca2+/calmodulin dependent protein kinase II)抑制剂购于Selleck公司；Calyculin A：PP1、PP2A (Protein phosphatases 1 and 2A) 抑制剂购于Genne Operation公司；荧光染色剂Fluo-4 AM：购于东仁化学科技(上海)有限公司；其它试剂均购于Sigma公司。

1.2 仪器

生理多导记录仪(PowerLab 8/35, AD Instruments, 澳大利亚)；放大器(35-2083 Rev. F Millar)、双压力容积导管(SPR-901 型) (MILLAR公司，美国)；Olympus IX53倒置显微镜(Olympus公司, 日本)；科研级高灵敏致冷CCD (ZYLA-5.5-CL3, ANDOR公司，英国)；超高速波长切换装置(Lambda DG-4, Sutter, 美国)；灌流给药系统(VC3-8, ALA公司，美国)。

1.3 实验动物

雄性SD大鼠(300～350 g)，购于南京中医药大学实验动物中心，实验动物使用许可证：SYXK(苏)2011-0053；动物实验伦理批准号：ACU171115；在恒温、各12 h明暗周期的饲养室内，自由进食和饮水。

1.4 浓度设计

根据大鼠在体预实验，苍术素剂量选择能够引起最大药效的最低剂量(大约)，最终选择浓度为3 mg/kg苍术素进行在体实验。根据文献报道，H89对PKA抑制的IC50(half maximal inhibitory concentration)为135 nmol/L[14]，KN-93对CaMKII抑制的IC50为370 nmol/L[15]，Calyculin A (CA)抑制PP1的IC50为2 nmol/L，抑制PP2A的IC50为0.5～1 nmol/L[16]。因此离体大鼠心脏及细胞实验中，H89，KN-93及CA分别选择为200 nmol/L, 500 nmol/L, 10 nmol/L，以确保其PKA, CaMKII, PP1及PP2A超过半数活性被抑制。

1.5 在体大鼠压力-容积环分析

雄性SD大鼠经腹腔注射20%乌拉坦(5 ml/kg)麻醉。已定标的双压力Millar导管经右侧位的颈总动脉插入到大鼠的左心室内，手术线固定。打开Labchart 8软件调整导管在心室内的位置，直到压力-容积环呈现规则的矩形状[16,17]。大鼠的左心室压、左心室容积、主动脉收缩压及主动脉舒张压均稳定时，即停止调节导管位置。记录给药前各指标作为空白对照，空白对照记录结束后，将苍术素溶于DMSO (0.3 ml)腹腔注射，待药效稳定后记录大鼠加药后各血流动力学参数，如左心室发展压(left ventricular developed pressure, LVDP)、搏出功(stroke work, SW)、心输出量(cardiac output, CO)、心率(heart rate, HR)、动脉收缩压(systolic blood pressure, SBP)和动脉舒张压(diastolic blood pressure, DBP)。实验结束后，自颈静脉推注30%高渗盐水20～50 μl及取自身血液进行容积定标，采用6只大鼠重复上述实验 (n=6)。前期实验表明0.3 ml DMSO腹腔注射对大鼠血流动力学参数无明显作用(实验数据未显示)。

1.6 离体大鼠心脏左心室收缩力分析

雄性SD大鼠麻醉同在体实验，取心脏置于0℃至4℃无钙台氏灌流液中，使其停搏。离体大鼠心脏挂于已充满灌流液的Langendorff装置上，在充氧 (95% O2+5% CO2)，温度为(37.5±0.5)℃条件下，经主动脉逆行灌流，灌流压为90 cm H2O (1 cm H2O=0.098 kPa)。经由左心房插入左心室，连接RM6240型多道生理信号采集处理系统，记录左心室收缩曲线。刺激器通过一对刺激电极约5 V的刺激强度加于离体心脏心房两侧，刺激心脏以4 Hz固定频率(即心率240)进行起搏[17]。以含钙灌流液为母液配制成相应浓度药物依次灌流给药，正常灌流液→ 0.1→1→10 μmol/L 苍术素浓度梯度灌流；或正常灌流液→200 nmol/L H89 (PKA抑制剂)→200 nmol/L H89+10 μmol/L 苍术素；或正常灌流液→500 nmol/L KN-93 (CaMKII抑制剂)→500 nmol/L KN-93+10 μmol/L 苍术素；或正常灌流液→10 nmol/L Calyculin A (PP1, PP2A抑制剂)→10 nmol/L Calyculin A+10 μmol/L 苍术素。记录参数为左心室发展压 (LVDP, Left ventricular develop pressure)，该离体心脏实验每组重复6例 (n=6)。灌流液的组成 (mmol/L): NaCl 135, Glucose 10, KCl 5.4, HEPES 5, MgCl21, NaH2PO40.33, CaCl21.8, NaOH调pH至7.3。

1.7 大鼠左心室心肌细胞钙释放测定

雄性SD大鼠麻醉方法同在体实验，大鼠离体心脏置于Langendorff装置上灌流，用含2 mg/ml CollagenaseⅡ的灌流液消化后。剪取心脏于无钙台氏灌流液中充分剪碎过滤，静置后用无钙台氏灌流液冲洗2次。随后用0.25 mmol/L, 0.5 mmol/L, 1 mmol/L钙离子的台氏液进行梯度复钙。随后细胞悬液加入钙荧光指示剂Fluo-4 AM (5 μmol/L)于37℃避光孵育30 min。孵育后细胞用于实验，外液为含钙 (1.8 mmol/L)台氏液[18]。由刺激器通过一对刺激电极以1 Hz，15 V的强度加于心肌细胞两侧，刺激细胞收缩。单色激发光源发出激发光，通过耦合系统引入荧光显微镜，并聚焦到细胞表面，激发细胞中的荧光探针Fluo-4 AM发出荧光，采用空气冷却用CCD相机采集并记录荧光信号。激发波长为488 nm，吸收波长510 nm[16]。加药顺序同上实验，该实验重复6例 (n=6)。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 苍术素对在体大鼠血流动力学的影响

双压力Millar导管能够同时记录左心室压力、左心室容积及主动脉压力。结果表明，苍术素(3 mg/kg)显著增加搏出功(SW)、心输出量(CO)及心率(HR)，显著降低动脉舒张压(DBP)，而对左心室发展压(LVDP)和动脉收缩压(SBP)无明显影响(表1)。

Tab. 1 Effects of atractylodin (3 mg/kg) on left ventricular and aortic hemodynamic parameters of normal anesthetized rats n=6 )

2.2 苍术素及苍术素在H89或KN-93或Calyculin A干预下，对大鼠离体心脏收缩力的影响

大鼠离体心脏灌流实验被用于分析苍术素对心脏的直接作用，通过给予固定频率(4 Hz)刺激离体心脏，可排除频率对左心室收缩力的影响。并且证实苍术素的正性肌力作用是独立于神经体液调节，且PKA 抑制剂 H89能够阻断苍术素的正性肌力作用。结果表明，(1)苍术素(0.1, 1, 10 μmol/L)浓度依赖性增加大鼠左心室发展压；(2)H89 (200 nmol/L)及KN-93 (500 nmol/L)均能显著性降低大鼠LVDP；Calyculin A (10 nmol/L) 能显著性增加大鼠LVDP；(3)只有H89 (200 nmol/L)能够阻断苍术素(10 μmol/L)增加LVDP的作用，而KN-93 (500 nmol/L)及Calyculin A (10 nmol/L)均未能阻断苍术素增加LVDP的作用(表2)。

Tab. 2 Effects of atractylodin on isolated rat left ventricular developed pressure (LVDP) or Ca2+ transient amplitudes from left ventricular myocytes in the absence and presence of H89 or KN-93 or calyculin A n=6 )

2.3 苍术素及苍术素在H89或KN-93或Calyculin A干预下，对大鼠左心室心肌细胞钙释放的影响

为了探究苍术素(Atractylodin)在体及离体心脏的正性肌力作用的机制，而采用左心室肌细胞钙释放实验。实验采用PKA 抑制剂H89、CaMKII抑制剂 KN-93、PP1, PP2A抑制剂Calyculin A干预atractylodin对钙释放的作用。实验结果表明，(1)苍术素(10 μmol/L)增加大鼠左心室钙释放幅值；(2)H89 (200 nmol/L)及KN-93 (500 nmol/L)均能显著性降低钙释放幅值；Calyculin A (10 nmol/L) 能显著性增加钙释放幅值；(3)只有H89 (200 nmol/L)能够阻断苍术素(10 μmol/L) 增加钙释放幅值的作用，而KN-93 (500 nmol/L)及Calyculin A (10 nmol/L)均未能阻断苍术素增加钙释放幅值的作用。苍术素及3个抑制剂对大鼠左心室钙释放幅值作用的统计结果及代表性曲线见表2及图1。

Fig. 1 Representative curves of rat left ventricular myocyte Ca2+ transient changes by atractylodin (10 μmol/L) in the absence (A) and presence of H89 (PKA inhibitor) (B) or KN-93 (CaMKII inhibitor) (C) or CA (Calyculin A, PP1 and PP2A inhibitor) (D)

钙释放曲线分为快速上升相及下降相，上升相主要由RyR2通道开放引起，下降相主要由肌浆网钙泵2a (SERCA2a)回吸收，以及通过Na+-Ca2+交换体(NCX)及质膜上的钙泵(PMCA)外排至细胞外引起的。其中SERCA2a的回吸收介导了快速下降相(α)，NCX和PMCA外排介导了缓慢下降相(β)。苍术素(10 μmol/L)显著增强SERCA2a介导的快成分，其衰减速率常数α值显著增加(5.11±0.99 in control to 5.67±1.01 with atractylodin,P<0.01,n=6)；并降低NCX和PMCA介导的慢成分，其衰减速率常数β值显著降低 (0.22±0.07 in control to 0.18±0.07 with atractylodin,P<0.01,n=6)。PKA抑制剂H89(200 nmol/L)能够降低衰减速率常数α值(5.78±0.63 in control, 5.55±0.56 with H89, 5.17±0.52 with H89+Atractylodin,P<0.05,n=6)；并不影响β值(0.19±0.07 in control, 0.19±0.07 with H89, 0.21±0.07 with H89+Atractylodin,P>0.05,n=6)。钙释放下降相拟合曲线见图2。

Fig. 2 The decaying phase curves of Ca2+ transients from rat left ventricular myocytes were presented as the relationships between timings of ms in X axis and the log10 fluorescence intensities in Y axis. The curves were expressed as an equation of y=A×e-αt+B×e-βt. The equation of fast component was described as y=A×e-αt and slow one as y=B×e-βt. (A) and (B) were the representative two exponential fittings before and after atractylodin (10 μmol/L). (C), (D) and (E) were the representative two exponential fittings in control, H89 and H89+atractylodin treatment. (F) and (G) were the original data of α and β before and after atractylodin administration, (H) and (I) were the raw data of α and β in control, H89 and H89+atractylodin treatment

3 讨论

苍术素通过作用于葛瑞林(Ghrelin)信号通路改善心衰状态的小鼠心脏功能[7]，虽然文献报道了苍术素具有改善心衰状态的作用，但有关苍术素是否对心脏有直接作用；苍术素对心脏作用的血流动力学特点的影响；心肌细胞的ghrelin受体是否介导苍术素的心脏作用；介导苍术素心脏作用的亚细胞作用靶点与ghrelin受体的关系等问题尚不十分清楚。本研究中的在体及离体实验均表明苍术素具有正性肌力作用，这种作用是基于苍术素增加心肌细胞钙释放的幅值。进一步对钙释放的分析表明，钙泵(SERCA2a)活性增加导致胞浆钙回吸收增加，是苍术素增加钙释放幅值增加作用的原因。而离体实验表明苍术素的正性肌力作用是源于其对心脏的直接作用。钙离子在调控心脏收缩和舒张过程中发挥重要作用，钙稳态紊乱则会导致心脏功能异常[19]，其中就包括心力衰竭，其主要特征就是心脏收缩力降低。大量研究表明，SERCA2a表达或活性的降低是导致心脏收缩力下降的重要因素[20]。心肌细胞钙释放实验进一步证明，苍术素增加钙释放的作用能够被PKA抑制剂H89所阻断。PKA是磷酸化受磷蛋白(phospholamban, PLB) (16位磷酸化位点)的主要蛋白激酶，而磷酸化的PLB能够增加肌浆网钙泵(SERCA2a)的功能[21]。本研究虽然不能排除正性肌力作用的其它作用机理，但PKA-SERCA2a途径是苍术素发挥正性肌力作用的机制之一。

本研究采用双压力容积导管，同时分析苍术素对心脏及血管的血流动力学效应，心室容积指标的测量可准确分析心输出量。苍术素显著增加大鼠心脏的搏出功及心输出量，表现出苍术素明显的正性肌力作用。此外，苍术素还能增加心率。苍术素引起心输出量及心率增加并没有导致收缩压增加，反而导致舒张压下降。合理的解释是由于苍术素能够引起外周血管扩张导致外周阻力下降，而在体实验中苍术素导致心率上升可能是外周阻力下降后引起的代偿性心率增加，而不是苍术素对心脏的直接作用。事实上，ghrelin作用于血管上ghrelin受体导致血管扩张[22]，苍术素具有增强ghrelin受体信号通路作用[8]。因此，可以预见苍术素能够导致外周血管扩张，但苍术素对血管扩张的直接证据有待进一步研究。离体心脏实验能够直接观察苍术素对心脏的作用，还能排除神经体液因素的参与。本研究为了进一步排除心率对心室发展压的影响，采用电刺激(4 Hz)离体大鼠心脏，确保实验过程中离体心脏心率保持着每分钟240次。结果表明，苍术素能够浓度依赖性增加大鼠左心室发展压，其作用能够被PKA抑制剂所阻断，表明苍术素的正性肌力作用是ghrelin-PKA通路介导。心肌细胞钙释放实验进一步证明苍术素能够增加胞浆钙释放幅值，虽然不能确定苍术素增加钙释放幅值是其正性肌力作用的唯一机制，但可以明确钙释放幅值增加是苍术素正性肌力作用的主要因素。此外，对CaMKII抑制剂KN-93及PP1和PP2A抑制剂Calyculin A 不能阻断苍术素增加心肌细胞钙释放幅值，而PKA抑制剂H89能够显著阻断苍术素对其作用，与离体心脏实验结果相一致。本实验室首次采用静脉给药“药物浓度-时间关系”分析法[17]，对钙释放进一步分析，表明苍术素增加钙释放幅值是基于其增加SERCA2a活性，促进钙回吸收增加。事实上，钙释放幅值的增加主要是肌浆网内与胞浆之间的钙浓度差，短期的钙释放幅值增加依赖于兰尼碱受体(RyR2)开放程度，但稳定的钙释放幅值增加依赖于SERCA2a的活性[23]。

综上，苍术素具有正性肌力作用，其作用机制通过PKA-SERCA2a通路发挥其作用。在发挥正性肌力作用的同时，还能扩张外周血管降低舒张压，可为其作为先导化合物开发用于临床治疗心力衰竭的药物而提供了理论基础。