纳米二氧化硅复合寒冷对A549细胞毒性及其炎性因子分泌的影响*

张 莉， 张永强， 李 曦， 武 帅， 杨丹凤

((军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所， 天津 300050)

近年来，随着灰霾、雾霾问题的日益严重，其对人体健康的影响备受关注。室外大气污染被国际癌症研究机构(IARC)列为人类致癌诱因之一。

大气颗粒物成分复杂，按空气动力学大小可分为可吸入颗粒物(PM10，空气动力学直径<10 μm)、细颗粒物(PM2.5，空气动力学直径<2.5 μm)、超细颗粒物(UFPs，空气动力学直径<0.1 μm)[1]。已有研究报道，超细颗粒物更容易透过肺气血屏障，随血液循环沉积在各组织脏器中，对健康的危害更大[2]。

大气颗粒物中的硅元素占很大的比例，主要以氧化形式存在，SiO2是其重要的一员[3]。近年来，随着纳米材料在工业和日常生活中的广泛应用，大大提高人们暴露于纳米颗粒物的几率。如纳米硅颗粒，由于其高丰度、高能量密度和良好的热、化学性质，已经被作为一种潜在的能量载体[4]。纳米硅颗粒被普遍认为是低毒甚至是无毒的，但体内实验表明，对小鼠气管滴注低剂量的纳米硅，具有急性或亚急性的肺毒性[5]。纳米二氧化硅(Nano-SiO2)颗粒与UFPs一样，能透过生物屏障进入血液循环并沉积在靶器官中，发挥着潜在的生物学毒性效应[6]。流行病学、临床和病理研究表明，吸入SiO2可引起肺组织的炎症反应并释放炎症因子，与矽肺、慢性支气管炎、肺癌等肺部疾病相关[7]。

与此同时，越来越多的研究发现，低温刺激和冷空气可使呼吸系统疾病，如哮喘、上呼吸道感染、慢性支气管炎、肺炎等的发病风险明显增加[8]。我国近几年冬季雾霾天气尤为严重，在冬季气压低、空气流通性差，颗粒物漂浮于空气中更易随冷空气吸入体内，以致机体面临超细颗粒物及寒冷暴露的双重刺激。

A549细胞为人肺腺癌上皮细胞模型，与呼吸性毒物有紧密联系，在毒理学体外研究中得到广泛使用，该细胞易于培养、对外界刺激较为敏感，被应用为评价外来物质诱导炎症反应能力的理想模型。因此，本研究以Nano-SiO2颗粒作为超细颗粒物代表，探讨Nano-SiO2与寒冷复合暴露对A549细胞毒性及其炎性因子分泌的影响，为进一步揭示冬季雾霾天气对人类健康的潜在危害提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞与材料

A549细胞购自中科院上海细胞库；Nano-SiO2(平均粒径<40 nm，纯度99.9%，结晶型)购自上海润和纳米有限公司。

1.2 试剂

胎牛血清(Hyclone，美国)，高糖DMEM培养基(Hyclone，美国)，胰蛋白酶(Gibco，美国)，青-链霉素双抗溶液(Gibco，美国)，Trizol(Invitrogen，美国)，Ex Taq(TaKaRa，日本)，SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa，日本)，引物(上海生工，中国)，IL-6，IL-8 ELISA检测试剂盒(武汉博士德生物有限公司，中国)，CCK8检测试剂盒(同仁，日本)，乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所，中国)。

1.3 仪器

CO2细胞恒温培养箱(Thermo，美国)，TGL-6台式高速冷冻离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司，中国)，酶标仪(Tecan，瑞士)，BK-900C超声波清洗器(巴克超声设备有限公司，中国)，倒置显微镜(Olymbas，日本)，ABI-7300型PCR仪(ABI，美国)，PCR仪(Bio-Red，美国)。

1.4 Nano-SiO2混悬液制备

用电子天平准确称取Nano-SiO220 mg，加入10 ml的FBS后密封，使用漩涡振荡器初步震荡混匀；置于超声清洗仪中超声震荡8 h(期间每2 h漩涡震荡混匀一次)，振动频率为60 Hz，制成2 mg/ml的Nano-SiO2母液。再用染毒母液配制成10 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml和200 μg/ml的染毒培养液。

1.4.1 细胞培养 A549细胞用高糖DMEM培养基(含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素)在37℃、体积分数5%的CO2条件下传代培养。

1.4.2 CCK8检测细胞存活率与分组 将A549细胞按每孔5×103cells/ml接种于96孔板中，将细胞分为对照组和实验组，对照组加入培养液正常培养条件下培养，实验组分别用10, 50, 100, 200 μg/ml Nano-SiO2对A549染毒和/或31℃，33℃，35℃低温孵育，继续培养48 h后，每孔加入10 μl CCK-8试剂，继续培养4 h后，采用酶标仪测定450 nm处吸光度值，计算细胞相对存活率。公式为：细胞相对存活率=(OD实验组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)×100%。

选出对A549细胞存活率影响显著的温度和Nano-SiO2剂量的基础上，进行2×2析因设计实验，分为4组：37℃对照组；Nano-SiO2染毒组；低温暴露组；Nano-SiO2和低温复合组。将A549细胞按每孔5×103cells/ml接种于96孔板中，在不同培养条件下培养48 h后，通过倒置显微镜观察细胞形态，参照上述方法检测细胞相对存活率。

1.4.3 LDH的测定 A549细胞接种于6孔板培养过夜后，吸弃各孔的培养液，Nano-SiO2染毒组、Nano-SiO2和31℃复合组加入100 μg/ml的Nano-SiO2染毒培养液，对照孔和31℃低温组加入等体积的正常培养液，实验均设置 3个复孔。按照不同条件继续培养 48 h后，收集细胞培养液，3 000 r /min 离心10 min，取上清液，采用比色法检测LDH活性，操作按试剂盒说明进行。

1.4.4 IL-6、IL-8细胞炎性因子的测定 A549细胞在不同的条件下培养48 h，收集细胞培养上清液，利用ELISA法测定白细胞介素6(IL-6)和白细胞介素8(IL-8)含量，实验具体步骤严格按试剂盒说明进行。

1.4.5 qRT-PCR检测IL-6和IL-8基因表达水平 A549细胞在不同条件下培养48 h后，离心收集细胞，使用Trizol试剂盒提取细胞总RNA，利用逆转录试剂盒将RNA逆转为cDNA，反应体系如下：30 μl反应体系中RNA 3 μl，5×Prime Mix 6 μl，补足RNAnase free water至30 μl。置于PCR仪按如下程序反应：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃ 5 min。将上述所得cDNA进一步行qRT-PCR检测，反应体系：20 μl反应体系中，cDNA 1 μl，SYBR Ex Taq Ⅱ 10 μl，Dye 0.4 μl，上、下游引物各0.4 μl，RNAnase free water 7.8 μl。qRT-PCR反应条件：94℃ 30 s →60℃ 31 s→72℃ 30 s，共40个循环(引物序列见表1。根据内参Ct值，利用2-ΔΔCt法计算各目的基因的相对表达量。

Tab. 1 qRT-RCR primer sequences

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 不同低温和不同剂量Nano-SiO2对A549细胞相对存活率的影响

结果表明，与37℃对照组相比，35℃、33℃和31℃组细胞相对存活率分别为 (87.414.67)%、(77.133.66)%、 (60.022.54)%，随温度的降低细胞相对存活率随之降低(P<0.05，图1A)，其中以31℃组细胞相对存活率降低最为显著。与对照组相比，10 μg/ml Nano-SiO2、50 μg/ml Nano-SiO2、50 μg/ml Nano-SiO2和100 μg/ml Nano-SiO2剂量组A549细胞相对存活率分别为(95.241.85) %，(94.635.20)%，(83.622.23)%，(75.661.02)%，随着染毒剂量的增加细胞相对存活率随之降低(P<0.05，图1B)，其中以100 μg/ml Nano-SiO2组细胞相对存活率降低最为显著。

根据单因素结果分析，100 μg/ml Nano-SiO2和31℃低温对A549细胞存活率影响显著，按照2×2析因设计实验，分为4组：对照组(不施加Nano-SiO2，常温37℃)；单一Nano-SiO2染毒组(100 μg/ml)；单一低温组(31℃)；100 μg/ml Nano-SiO2和31℃低温复合组。

Fig. 1 Effects of different factors exposure on relative cell survival rate of A549 cells (n=6)

2.2 Nano-SiO2复合低温对A549细胞相对存活率的影响

结果表明，与对照组比较， 31℃冷暴露组、100 μg/ml Nano-SiO2及复合组细胞相对存活率分别为(76.351.89)%、(60.022.54)%、(47.762.73)%， 均显著降低(P<0.01)；冷暴露组相比染毒组细胞相对存活率显著降低(P<0.01)；与31℃冷暴露组和100 μg/ml Nano-SiO2染毒组比较，二因素复合组细胞相对存活率降低更为显著(P<0.01)，且统计分析具有协同作用(表2)。

Tab. 2 Effects of different exposure conditions on activity of A549 cells n=6)

2.3 Nano-SiO2复合低温对A549细胞LDH活性的影响

结果表明，对照组、31℃冷暴露组、100 μg/ml Nano-SiO2及复合组细胞培养液中 LDH 活性分别为(198.939.42)U/L、(316.6114.01)U/L、 (350.5511.91)U/L、(483.1711.29)U/L。与对照组相比，各条件下细胞培养上清液中 LDH 活力均显著升高(P<0.01)；冷暴露组相比染毒组LDH活力显著升高(P<0.01)；与31℃冷暴露组和100 μg/ml Nano-SiO2染毒组比较，二因素复合组LDH显著升高(P<0.01)，且统计分析具有协同作用(表3)。

Tab. 3 Effects of different exposure conditions on LDH content in A549 cell culture solution n=3)

2.4 Nano-SiO2复合低温对A549细胞IL-6和IL-8质量浓度的影响

结果表明，与对照组相比，低温组及复合组IL-6水平显著升高(P<0.01)，染毒组IL-6水平有升高的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；冷暴露组相比染毒组IL-6水平显著升高(P<0.01)。IL-8水平在低温组、Nano-SiO2染毒组和复合组均显著高于对照组(P<0.01)；染毒组相比冷暴露组IL-8水平显著升高(P<0.01)。与31℃冷暴露组和100 μg/ml Nano-SiO2染毒组比较， 二因素复合组IL-6、IL-8水平均显著升高(P<0.01)，且统计分析具有协同作用(表4)。

Tab. 4 Effects of different exposure conditions on IL-6 and IL-8 levels in A549 cell culture medium (pg/ml, n=3)

2.5 Nano-SiO2复合低温对A549细胞IL-6和IL-8 mRNA表达的影响

结果表明，与对照组相比，31℃低温组及复合组IL-6 mRNA水平明显升高(P<0.05)，而单一100 μg/ml Nano-SiO2染毒组差异无统计学意义(P> 0.05)。与染毒组相比，冷暴露组IL-6水平显著降低(P<0.01)。复合组IL-8 mRNA水平显著高于对照组(P<0.01)，而单一Nano- SiO2染毒组及31℃低温暴露组IL-8 mRNA有升高的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。与31℃冷暴露组和100 μg/ml Nano-SiO2染毒组比较，二因素复合组IL-6、IL-8 mRNA表达均显著升高(P<0.01)，且统计分析具有协同作用(表5)。

Tab. 5 Effects of different exposure conditions on IL-6 and IL-8 mRNA levels in A549 cells n=3)

3 讨论

流行病学认为，大气颗粒物和低温刺激都可能诱发呼吸系统疾病发生和死亡的几率增加，并且两者同时存在时的影响更为显著[9]。但是考察颗粒物与寒冷复合作用对机体影响的研究极少，以往通过采用广义相加模型等方法证实颗粒物和气温对呼吸系统的影响存在交互协同作用[10, 11]。

纳米SiO2颗粒在空气颗粒物成分中所占比例很大， 因此本研究以人肺腺癌A549细胞作为研究对象，观察Nano-SiO2复合寒冷暴露对A549细胞毒性及其炎性因子分泌的影响，结果表明Nano-SiO2染毒可明显抑制A549细胞活性，且随染毒剂量的增加而增加；当给予低温刺激后，A549细胞活性也受到影响，其中低温组(31℃)细胞活性抑制较为显著。而当100 μg/ml Nano-SiO2和31℃低温复合作用A549后，对细胞活性的抑制具有协同作用，其中复合组细胞活性抑制最为明显。由此可见，低温刺激可增加Nano-SiO2颗粒对呼吸系统的影响。

据报道，毒性物质或外界刺激作用细胞的常见早期反应是细胞膜通透性的改变。故胞浆中的LDH释放到细胞外的水平可作为细胞膜受损的标志之一[12, 13]。在本研究中，同样观察到随着100 μg/ml Nano-SiO2染毒及31℃低温暴露，细胞培养上清液中LDH活性呈增加趋势，且在复合作用时细胞培养液中LDH的增加最为明显。结果表明Nano-SiO2复合寒冷可加重细胞损伤。

已有研究认为，PM2.5暴露可造成肺泡巨噬细胞毒性，诱导炎症因子表达增加，从而促进呼吸道炎症的发生[14-16]。IL-6和IL-8是一类多向性促炎症因子，具有增强多种炎症介质、促进炎性细胞聚集的作用，亦是反映机体急性炎症损伤的重要指标，且IL-6和肺表面活性蛋白A是免疫防御功能的物质基础[17]。而极端低温会引起气道结构和功能改变，易于滋生细菌，破坏肺部免疫防御系统，进而加重 PM2.5 的毒性作用，本课题组另一项研究通过气管内滴注Nano-SiO2和零下10℃复合暴露来评估全身炎症反应，发现复合暴露可以上调促炎性细胞因子，并影响白/棕色脂肪组织的可塑性[18]。

本研究中观察到，无论细胞培养液上清中IL-6和IL-8的水平还是A549细胞中IL-6和IL-8 mRNA表达量，100 μg/ml Nano-SiO2和31℃低温复合组显著高于其他各组。表明Nano-SiO2和低温复合暴露可加重肺泡巨噬细胞毒性，增加炎症因子表达，促进及加重呼吸道炎症。

有关Nano-SiO2和低温刺激抑制细胞活性及促进细胞炎性因子增加的可能机制为外界刺激作用于A549细胞后，细胞内发生氧化应激反应，导致细胞炎性因子如IL-6和IL-8反应性增加，以及大量超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)的生成，并参与脂质过氧化反应，大量的过氧化物与自由基攻击细胞膜并导致细胞膜破坏，细胞内大量LDH渗出，抑制细胞增殖，降低细胞活性，严重时导致细胞死亡[19]。而其具体作用机制将在后续研究中进一步探讨。

综上所述，本研究着眼于Nano-SiO2颗粒染毒与寒冷暴露的复合作用进行的初步研究，研究结果显示，低温及Nano-SiO2颗粒染毒均可降低A549细胞活力和升高炎性因子分泌，且Nano-SiO2和低温复合暴露对细胞活性损伤严重及细胞炎性因子IL-6和IL-8的表达水平升高的影响最为显著，二因素具有交互协同作用，这一结果可为冬季雾霾天气对健康的潜在危害提供理论基础，以及对制定预防措施有指导意义。