69份国外小麦品种(系)抗叶锈性鉴定及基因分析

王思曼，张 静，张培培，Gebrewahid Takele Weldu，闫晓翠，刘大群，李在峰

(河北农业大学植物保护学院植物病理学系小麦叶锈病研究中心/河北省农作物病虫害生物防治技术创新中心/国家北方山区农业工程技术研究中心,河北保定 071001)

小麦叶锈病是由小麦叶锈菌(Pucciniatriticina)引起的气传真菌性病害，发病严重时可造成小麦高达40%以上的减产，已成为全世界小麦最重要的病害之一[1-2]。近年来由于全球气候变暖，叶锈病在我国有加重的趋势，特别是2012和2015年，叶锈病在河南、山东、陕西和甘肃等省大面积发生[3]，造成了严重的经济损失。由于小麦叶锈菌生理小种变异，小麦抗病基因抗性频繁丧失，因此明确小麦品种中所携带的抗病基因对于抗病品种的选育和合理布局有重要意义。

小麦抗叶锈病基因可分为小种专化抗病基因和非小种专化抗病基因[4]。目前国内外发现的小麦抗叶锈病基因有100多个，已经被正式命名的有79个[5]，大多数表现为全生育期抗病，为小种专化抗病基因。成株抗叶锈病基因有12个[6]，其中Lr34[7]、Lr46[8]、Lr67[9]和Lr68[10]为成株慢锈基因，成株慢锈基因一般为非小种专化抗病基因[11]。目前，我国许多抗叶锈病基因已丧失抗性，仅有Lr9、Lr19、Lr24、Lr38、Lr47、Lr51和Lr53等少数抗叶锈病基因仍具有良好抗性[12-13]。因此，不断发掘新的抗病基因，并利用抗病基因防治小麦叶锈病至关重要。

基因推导结合分子标记技术可以快速鉴定出小麦品种中所携带的抗叶锈病基因。赵丽娜等[14]对23份小麦微核心种质材料进行了苗期抗性鉴定和标记检测，共推导出Lr1、Lr10等13个抗叶锈病基因。Ren等[15]在84份冬小麦材料中推导出Lr1、Lr3等12个抗叶锈病基因。Takele等[16]利用基因推导的方法在我国83份品种(系)中推导出Lr1、Lr26等9个抗叶锈病基因。

国内外小麦种质资源丰富，很多材料都携带有效的抗叶锈病基因，了解这些材料中所携带的抗叶锈病基因，可为抗病育种和基因布局防治小麦叶锈病提供有效抗源材料。本试验选用69份国外小麦品种(系)进行苗期和成株抗叶锈性鉴定，同时结合分子标记检测供试材料中所携带的苗期及成株期抗叶锈病基因，以期为合理实施抗病基因布局、防治小麦叶锈病提供参考信息。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料包括36份已知抗病基因的近等基因系、69份从国外引进材料中筛选出来的小麦品种(系)、感病对照郑州5389和成株期慢锈对照SAAR，以及17个小麦叶锈菌生理小种(具体见表1)和田间成株期所用的混合生理小种(TGPS、PHTS和FHSS)均由河北省农作物病虫害生物防治工程技术研究中心提供。69份国外小麦品种(系)中，5份来自罗马尼亚(Romania)，10份来自南斯拉夫(Yugoslavia)，54份来自国际玉米小麦改良中心(CIMMYT)，具体名称见表2。17个叶锈菌生理小种是由提供者根据Long等[17]提出的四字母命名法进行命名。

1.2 苗期基因推导及抗叶锈性鉴定

将所有供试材料播种于温室育苗穴盘中，共播种17套。待小麦第一片叶片完全展开后，采用扫抹法将17个不同毒力的叶锈菌生理小种分别接于17套小麦叶片上，黑暗保湿16 h，再将其移入光照温室(约25 ℃)培养大约两周，待感病对照郑州5389充分发病后，按照Roelfs等[18]的6级分级标准进行侵染型鉴定。利用Dubin等[19]提出的基因推导原则对69份小麦品种(系)进行基因推导。

1.3 田间接种及成株期抗叶锈性鉴定

于2017-2018年度将所有材料分别播种于河北保定河北农业大学试验田和河南周口黄泛区农场试验田。种植方法采用完全随机区组设计，设置两个重复，行长1.5 m，行距0.25 m，每10行种植一行感病对照郑州5389，并且在两侧垂直种植感病对照郑州5389作为诱发行。将用于田间接种的叶锈菌生理小种按等量的比例混合，制成含有0.05%吐温20的叶锈菌孢子悬浮液，在小麦分蘖期喷施于诱发行，并用地膜覆盖保湿 16 h。当感病对照郑州5389严重度达到50%时，开始按照Li等[20]的方法鉴定病害严重度，之后每周鉴定一次，待感病对照严重度达100%时，所调查数据即为最终严重度(final disease severity,FDS)。

1.4 数据分析

利用软件SAS 9.1进行方差分析，并计算品种间的LSD值。根据苗期和成株期的侵染型，将FDS明显小于或与慢性对照SAAR无显著差异的品种作为慢锈品种。

1.5 抗叶锈病基因的分子检测

用CTAB法[21]提取小麦叶片基因组DNA，用0.5×TE把DNA溶解成100 μL原液，用分光光度计检测提取DNA的纯度和浓度。用ddH2O将DNA原液稀释到40 ng·μL-1，作为进行PCR的模板DNA。选用与已知抗叶锈病基因Lr1[22]、Lr9[23]、Lr10[24]、Lr19[25]、Lr20[26]、Lr24[27]、Lr26[28-29]、Lr34[30]、Lr37[31]紧密连锁的分子标记进行检测，引物序列参照相应文献，由生物工程(上海)股份有限公司合成。所有引物的PCR反应体系为10 μL，包括1 μL 40 ng·μL-1DNA、 1 μL 40 μmol·L-1引物、5 μL 2×Taq PCR Mix、 3 μL ddH2O。各Lr基因PCR扩增按照相应文献进行，扩增后用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

2 结果与分析

2.1 苗期基因推导及分子标记检测结果

由表1可以看出，在36份已知抗病基因的近等基因系中， 携带Lr2c、Lr3、Lr16、LrB、Lr10、Lr3bg、Lr13和Lr14b这8个基因的载体品种对供试的17个叶锈菌生理小种均表现为感病，而携带Lr9、Lr19、Lr24、Lr28、Lr29、Lr42、Lr44、Lr47、Lr51和Lr53这10个基因的载体品种对所有供试小种均表现为抗病，因此这18个基因无法通过基因推导的方法在69份国外小麦品种(系)中鉴定出来，其余18个抗叶锈病基因对17个供试小种表现出不同的抗病性，可以在69份国外小麦品种(系)中被推导出来。根据基因推导结合分子标记检测结果发现，Lr1、Lr10、Lr19、Lr26、Lr34和Lr37存在于在69份国外小麦品种(系)中(图1)。

从表1和表2可以看出，Lr1对15个小种表现为抗性，而供试的国外材料中有8份小麦品种(系)(Lovrin-34、Transilvania-1、Agrounija、Sutjeska、CIM-3、CIM-14、CIM-26和CIM-42)的抗性与Lr1相同或较Lr1具有更广谱的抗性，其中，Transilvania-1、Agrounija和Sutjeska对Lr26无毒的小种也表现出抗性，表明这些材料可能同时携带Lr1和Lr26。分子标记检测发现，Transilvania-1、Agrounija、Sutjeska、CIM-3、CIM-14和CIM-26这6份材料与Lr1有相同的特异性片段，进一步说明这6份材料含有Lr1基因。Lovrin-34和CIM-42这两份材料只对TGPS和PHTS 2个小种表现感病，分子标记检测发现，这2份材料可能携带Lr10和Lr34。

Lr15对14个小种表现出抗性，而Flamura-80、CIM-31、CIM-41、CIM-49和CIM-51对这14个小种也表现为抗性，表明这些材料可能携带Lr15。其中，Flamura-80、CIM-31和CIM-49对Lr2a无毒的小种也表现出抗性，故推测这些材料可能也携带Lr2a。

Lr36对16个小种表现为低侵染型，而Fundulea-262、CIM-19、CIM-22、CIM-29、CIM-30、CIM-32和CIM-44对这16个小种也表现为抗性，表明这些材料可能携带Lr36。

Lr26对4个小种表现为低侵染型，而Fundulea-262、Lovrin-10、Transilvania-1、Agrounija、Posavka、Radusa、Stizanka、Sutjeska、CIM-23和CIM-50这10份材料与Lr26的抗性谱相似，表明这些材料可能携带Lr26。其中，Posavka和CIM-23对Lr11无毒的小种也表现出抗性，表明这2份材料可能同时携带Lr11和Lr26。利用分子标记检测发现，这10份材料与Lr26特异性片段一致，进一步说明这10份材料含有Lr26。

Lr11对3个小种表现出抗性，而Posavka、CIM-2、CIM-4、CIM-5、CIM-8、CIM-9、CIM-21、CIM-23、CIM-41、CIM-45、CIM-51、CIM-53和CIM-54这13份材料与Lr11的抗性谱相似，表明这些材料可能携带Lr11。其中，CIM-8和CIM-21对Lr3ka无毒的小种也表现出抗性，表明这2份材料可能同时携带Lr11和Lr3ka。

Lr45对3个小种表现为低侵染型，而CIM-2、CIM-4、CIM-11、CIM-27、CIM-28、CIM-35、CIM-38、CIM-45、CIM-46、CIM-47、CIM-53和CIM-54这11份材料对3个Lr45无毒小种也表现为低侵染型，表明这些材料可能携带Lr45。其中，CIM-2、CIM-4、CIM-27、CIM-28、CIM-35、CIM-38、CIM-45、CIM-47和CIM-54对2个Lr17低毒小种也表现为抗病，推测这些材料可能同时携带Lr45和Lr17。此外，CIM-11、CIM-27、CIM-35、CIM-46对9个Lr14a低毒小种表现出抗性，推测这4份材料可能同时携带Lr14a和Lr45。

分子标记检测发现，有18份国外小麦品种(系)检测到与Lr10相同的条带，但Lr10在苗期对所有供试小种均表现为感病，无法利用基因推导的方法鉴定出来。有5份供试小麦品种(系)与Lr19的抗性谱相似，即对17个叶锈菌小种均表现为高抗，分子标记检测发现，其携带有与Lr19一致的特异性片段，进一步表明这些材料中含有Lr19。Lr34和Lr37是成株抗病基因，无法进行苗期基因推导，利用分子标记检测发现，携带Lr34的材料有11份，携带Lr37材料的有26份。

在69份供试国外小麦材料中，有31份材料(Flamura-80、Fundulea-262、Agrounija、 Transilvania-1、Sutjeska、CIM-2、CIM-4、CIM-7、CIM-10、CIM-12、CIM-14、CIM-16、CIM-17、CIM-18、CIM-19、CIM-20、CIM-21、CIM-22、CIM-25、CIM-29、CIM-30、CIM-31、CIM-32、CIM-37、CIM-39、CIM-40、CIM-44、CIM-49、CIM-50、CIM-51和CIM-52)对所有供试叶锈菌小种表现为抗病，或仅对其中1个小种表现为感病，说明 这些材料中可能携带未知的抗叶锈病基因 (表2)。

M:DL2000; Z:郑州5389; 1:Flamura-80; 2:Fundulea-262; 3:Lovrin-10; 4:Lovrin-34; 5:Transilvania-1; 6:Agrounija; 7:Jarka; 8:Krajinka; 9:Lepenica; 10:Panonija; 11:Posavka; 12:Radus。 Lr19和 Lr26右上角的“+、-”表示检测所使用的标记不同。

2.2 田间成株期抗病性鉴定结果

对2017-2018年度河北保定和河南周口试验田的田间抗叶锈性鉴定数据进行方差分析发现，品种间、环境间以及品种与环境间的差异均极显著性，说明小麦抗叶锈性基因的表达受基因型和环境的共同影响。由表3可以看出，慢锈对照SAAR田间平均严重度为5.25%，47份小麦品种的FDS低于慢锈对照SAAR或与慢锈对照的FDS差异不显著，且在苗期对供试小种均表现为感病，表明这些品种为成株慢锈性品种。

表1 17个叶锈菌生理小种对36个含有已知抗叶锈病基因的品系的苗期侵染型

表2 17个叶锈菌生理小种对69份小麦品种(系)的苗期侵染型

表3 47份成株抗性品种苗期对混合小种的反应型及成株期在田间的最终严重度

3 讨 论

国外许多小麦品种携带有优良抗病基因，引进国外小麦品种在我国麦区种植，可以有效减轻小麦叶锈病对小麦的侵害，从而提高产量。因此，可以利用这些高抗品种作为抗源，培育抗性更加持久的抗病品种，用于我国农业生产。

经鉴定，本试验中69份国外材料的抗性基因是单个抗性基因或多个抗性基因聚合的形式存在。根据苗期基因推导发现，Lr1对Lr3ka、Lr30和Lr14a无毒的小种也表现出抗性，因此携带基因Lr1的小麦品种无法推导出这些基因；当材料中有Lr36时，不能推导出Lr1和Lr26；当材料中携带Lr20时，不能推导出Lr26；当材料中同时携带Lr15和Lr2a两个基因时，不能推导出Lr1；当材料中同时携带Lr15和Lr11两个基因时，不能推导出Lr26；而当在材料中同时携带Lr20和Lr45两个基因时，不能推导出Lr11。

根据苗期基因推导发现，有8份小麦品种与Lr1抗性相同或比Lr1表现出更广谱的抗性，分子标记检测发现，有6份品种携带有与Lr1相同的特异性片段，其余2份品种可能携带Lr10和Lr34。Lr10[32]位于1A染色体短臂上，研究发现，该基因已丧失抗性，本研究中Lr10在苗期对所有小种均表现为感病，只能利用分子标记检测该基因是否存在。因此，在鉴定供试品种中是否含有抗病基因时，需要基因推导与分子标记检测相结合互相验证，以确保试验结果的可靠性。

Lr26[33]位于1BL/1RS易位系上，多年来被广泛用于小麦抗病育种。本研究中共发现有10份小麦材料携带Lr26，通过系谱分析(http://www.wheatpedigree.net)发现，Transilvania-1、Sutjeska、Fundulea-262这3个材料的亲本都有AVRORA。Purnhauser等[34]发现品种AVRORA携带Lr26基因。因此，这3份小麦品种中含有的Lr26来自AVRORA。黄国红等[35]研究发现，品种Lovrin-10携带Lr26，这与本研究结果一致。

成株抗性基因Lr37[36]最早在小麦栽培品种VPM1中发现，本试验通过分子标记检测，共发现26份小麦品种携带有Lr37，所占比率达到 37.68%，这些品种在田间鉴定均表现出良好的抗性。Lr34[37]是成株慢锈基因，具有良好的抗叶锈性，本试验中共检测到11份品种携带Lr34，所占比率为15.94%，其在田间均表现为抗病。本研究共发现47份材料为成株慢锈品种，这些小麦材料可作为抗源用于培育持久抗叶锈病小麦品种。