利用KASP标记定位小麦群体中的无芒位点 Awn-4A.1

蒋钰婕，王君哲，赵佳男，许盛宝

(西北农林科技大学农学院，陕西杨凌 712100)

芒作为小麦穗部器官的组成之一，是小麦长期进化和适应环境的结果[1]。但由于芒不利于收割和储藏，经过数千年的人类选择，驯化的小麦(硬粒小麦和普通小麦)出现了短芒甚至无芒[2]。然而，芒的存在也有利于小麦的生长发育，同叶一样，芒也是光合作用的重要器官[2-4]，由于芒的光合面积大，处于光照的最佳位置，距离籽粒近，对于促进籽粒灌浆和提高粒重具有重要的作用[5]；芒中非绿色组织的细胞，尤其是表皮细胞的细胞壁增厚，有利于减少水分的蒸发[6]，在干旱条件下，芒对小麦有较明显的增产作用[7]。因此，芒对小麦适应干旱胁迫、促进籽粒灌浆和提高粒重均有重要意义[8-9]。

麦芒根据长度和形态，可以分为长芒、短芒、无(顶)芒、勾曲芒、短曲芒、长曲芒等多种形式[10]，主要由五个基因(A、B1、B2、B3和Hd)及多个微效基因共同决定[10]，其中，A基因促进芒的伸长，Hd基因促进钩芒的形成，B1、B2和B3可抑制芒的发育，且B1的抑制作用最强，B2其次，B3最弱[11]。B1可以使穗中下部完全无芒，只有顶部少量芒，位于5A染色体长臂末端，目前已克隆了候选基因TraesCS5A02G542800[12-13]；B2可以使整个穗部的芒长变短，定位在6B染色体 4.84 Mb的物理区间内[11]；B3控制顶部的芒长，但目前定位还不清楚；Hd也会对芒长产生抑制作用，可通过与B1、B2的组合来产生不同类型的芒[14]，定位于4A染色体上[15]。由此可见，芒长发育具有位置效应，而且芒长表型是由多基因互作的结果。中国春作为普通小麦的模式品种，是一个典型的无芒小麦品种。前人发现，当中国春的缺体系染色体3BS[16]、4AS[14]和6BL[14]分别缺失后，顶部都出现了芒；当染色体5AL缺失后，中部有芒伸出，表明目前已知的芒长基因并不全面，还有很多与芒长相关的基因尚未发现，从而限制了对芒长发育的分子基础与芒长基因的互作研究[14]。

SNP芯片技术作为一种高通量、低成本的基因自动分型检测方法，目前已被广泛用于小麦等多倍体作物的遗传研究[17]、小麦连锁图谱的构建[18]、种群结构分析[19]和小麦基因定位[20]。用SNP芯片结合传统的集群分离分析法 (bulked segregation analysis，BSA)，可快速检测2个不同表现型构建的混合池间的遗传差异，发现与目标性状显著关联的差异SNP的染色体富集区域，在富集区域内开发标记，可进行SNP基因分型[21]；再结合竞争性等位基因特异性PCR(kompetitive allele specific PCR，KASP)，可实现基因的精细定位和进一步SNP分型[22-23]。

本研究利用小麦无芒品种中国春和有芒品种MK147构建F2分离群体与重组自交系群体，用F2代分离群体中无芒与有芒株系分别构建DNA极端性状混合池，利用Wheat660K SNP芯片进行基因分型，并对其结果进行BSA分析，对群体中有关芒长的QTL进行初步定位；用KASP标记进行QTL验证和精细作图，并开发与之紧密连锁的分子标记，以期为分析芒形成的遗传机制和分子标记辅助选择育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

中国春(Chinese Spring， CS)是测序完成的模式小麦品种，MK147是由国际农业研究中心(International Center for Agricultural Research，ICARDA)引进的小麦耐热性品系[25-26]。本研究利用这两个普通小麦品种(系)作为亲本进行杂交，获得F1，自交得到F2分离群体，通过单粒传法，得到了MK147/CS组合的F5代重组自交系(RIL)群体。亲本中的CS属于无芒材料，尽管CS一直被认为是无芒的小麦，但其实顶部有很短的芒(顶部芒长<0.6 cm)，因此，本研究用顶部芒长小于0.6 cm作为无芒的标准。MK147属于长芒材料(芒长>4 cm)。F2群体及亲本于2016年10月至2017年6月种植于西北农林科技大学北校区试验地(陕西杨凌)。RIL群体及亲本于2018年10月至2019年6月种植于西北农林科技大学曹新庄试验地(陕西杨凌)。F2和RIL群体均按单粒播种的方式种植，RIL群体的每个株系种植成株行，行长2.0 m，行间距0.25 m，株距0.15 m，试验设置3次重复，田间管理按当地大田常规标准进行。

1.2 表型测定

于小麦蜡熟期，F2群体每个单株随机选取三个穗，RIL群体每个株系随机选取3个主茎穗，使用直尺分别测量小麦穗部上、中、下三部分的芒长；每个部分随机选取3个芒，取平均值作为该部分的平均芒长，用于表型及遗传分析。

1.3 DNA提取及混池构建

根据 F2分离群体的表型鉴定结果，从群体中随机选取15个无芒单株和15个有芒单株构建极端池。分别取新鲜嫩绿的叶片，使用CTAB法提取DNA[27]，用紫外分光光度计检测DNA浓度，再等量混合形成无芒池和长芒池。

1.4 SNP芯片分型及BSA分析

用Wheat660K SNP芯片(https://wheat.pw.usda.gov/ggpages/topics/Wheat660_SNP_array_developed_by_CAAS.pdf)进行混池SNP分型检测(北京博奥晶典生物技术有限公司)。利用Excel 2019软件处理SNP分型数据，剔除无多态性及低质量的SNP，筛选得到亲本及无芒、长芒池间纯合且有差异的SNP。参照中国春IWGSC.Ref.V1.0(http://www.wheat genome.org/) ，将差异SNP侧翼序列与基因组进行BLAST，获得SNP的物理位置信息。参考Wu等[24]的方法，设计Perl脚本计算目标染色体上每Mb中SNP数量进行滑窗统计，根据标记密度评估可能的目标区间。

1.5 KASP-SNP标记开发及初定位结果验证

根据SNP物理位置的分布和密度，使用在线平台PolyMarker网站(http://polymarker.tgac.ac.uk/)对候选SNP进行KASP设计，从中挑选出染色体特异的标记。在KASP标记正向引物5′ 端分别加上FAM或HEX荧光的接头序列，其中FAM接头序列为5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′，HEX接头序列为5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′，引物由上海生工生物工程有限公司合成。将KASP标记在群体中进行单倍型分析，若能将SNP的不同基因型区分开，说明该标记具有特异性，可以用来进行分子辅助选择。定位区间左侧标记SNP-1537引物序列为：1537F_FAM：CGTGTCAAAAGTTCTGACGAC；1537F_HEX：CGTGTCAAA-AGTTCTGACGAA；1537R：GTATCGTCT- CGTTGCACAGT。右侧标记SNP-4195引物序列为：4195F_FAM：GTGAAGTACAAGGATGAGGTGAAA；4195F_HEX：GTGAAGTACAAGGATGAGGTGAAG；4195R:CTCCCACATCTTGACGAGCA。

2 结果与分析

2.1 群体中芒长的遗传分析

CS为无芒品种，与有芒品系MK147杂交，F1代全部表现为有芒，但均为短芒，芒长显著短于有芒亲本(图1A)，表明CS中无芒性状受半显性单基因控制。芒在穗的不同位置长度不同，其中MK147中部最长，下部最短；而杂交F1代上部最长，下部最短(图1B)。

在F2群体中芒长呈现连续的变化(图2A)。无芒与有芒的株系在F2代中接近1/4的比例(表1)，表明群体中的无芒性状可能是由一个基因控制。在RIL群体中，以顶部芒长小于0.6 cm作为无芒标准，发现无芒株系有58个、有芒株系有62个，比例接近1∶1的比例(图2B)，进一步说明了群体中的无芒性状由单基因控制。

2.2 混合池构建结果和BSA分析

在MK147/CS的混池中筛选到8 904个有差异的SNP标记(图3A)。其中4 281个差异SNP集中分布在4A染色体上(图3B)，且差异SNP与总SNP的比例在4A染色体上最高，表明群体中控制芒长的QTL位于4A染色体。通过对4A染色体上每Mb中SNP数量进行滑窗统计，发现4A上的差异SNP大部分富集在37～105 Mb和446～468 Mb区间，表明4A染色体上有两个候选位点(图3C)。

2.3 定位区间的验证与缩小

根据Wheat660K 芯片在两个富集区间的SNP序列信息，开发了58个KASP标记，将这些标记在MK147/CS杂交的F2代群体458个株系中进行基因型检测，结果发现，无芒性状与37～105 Mb区间连锁更为紧密，定位于KASP标记SNP-1537与SNP-4195之间0.81 cM的遗传区间，对应于中国春参考基因组(IWGSC.Ref. V1.0)4A染色体上9.23 Mb(100.56～109.79 Mb)的物理距离(图4)，利用标记SNP-1537与SNP-4195对RIL群体的无芒和有芒株系进行基因型检测(图5)，其中，标记SNP-1537检测了121个株系，基因型和表型一致的达91.74%；标记SNP-4195检测了137个株系，基因型和表型一致的达94.89%。因此，再次验证了群体中芒抑制基因位点位于4A染色体上，并将其命名为Awn-4A.1，同时发现两个与Awn-4A.1紧密连锁的KASP标记SNP-1537和SNP-4195。

3 讨 论

芒长基因在生产上既有应用价值，也是研究小麦基因互作的一个重要表型。杜 斌等[10]研究发现，影响芒长的位点由多个基因共同控制。中国春中不同染色体的缺失均造成其无芒表型发生改变，表明还有许多与芒长相关的基因参与芒的发育，从而限制了对芒长这一性状发育的分子基础与互作机制的研究[14]。

图1 亲本和F1代芒长表现(A)及芒长统计(B)

A:F2群体；B：RIL群体。

表1 F2群体芒长的遗传分析及卡方检验结果

A：亲本与F2混池差异SNP的重叠关系；B：筛选的SNP在染色体上的分布，折线表示差异SNP与总SNP数的比例；C：4A染色体差异SNP的物理位置和密度，框表示SNP显著富集的区域。

本研究中发现的位于4A染色体上控制芒长的位点，是对全穗芒长的抑制，且表现为半显性，这与前人报导的五个芒长基因(A、B1、B2、B3和Hd)的表现都不同[11-15]，可能是一个新的芒长位点；Sourdille等[14]和宫 希等[15]研究发现，定位于4A染色体上的Hd也会对芒长产生抑制作用，但控制钩芒的形成[14-15]，与本研究中的芒长表型不同，可能不是同一个基因。因此，推测在中国春4A染色体上可能存在与Hd不同的另外一个基因来调控芒长，在抑制芒发育的过程中，可能一起发挥作用。

芒长是由多基因共同控制，这些基因间存在着复杂的相互作用。本研究鉴定到的位点定位于4A染色体上0.81 cM的遗传区间，对应中国春(IWGSC.Ref.V10)参考基因组9.23 Mb的物理位置，区间内含有多个候选基因，为进一步精细定位与克隆基因提供了基础。目前还未研究该位点与其他已知芒长位点的互作效应，但该位点能够抑制全穗芒长，因此，推测该位点可能在芒发育调控网络中处于较为核心的位置，深入研究将有助于建立芒发育基因的调控主线，以及逐步解析小麦芒长的基因互作机制。

A：F2群体控制芒长QTL的遗传图谱；B：F2群体与控制芒长QTL的物理图谱；C：F2群体关键重组体的标记基因型及子代验证表型。

红色点表示基因型与CS一致，蓝色点表示基因型与MK147一致。