不同肥料对无籽青柠檬种植地土壤肥效、微生物与酶活性的影响

吴彪，柯智，陈喜蓉，钟剑锋，林芳能，阳记萍

海南省林业科学研究院(海南省红树林研究院)，海南海口571100

柠檬(Citrus limon(L.)Burm.f.)，为双子叶植物纲芸香科柑橘属植物，又称洋柠檬、柠果、益母果等。台湾无籽青柠檬是青柠檬和四季柠檬的杂交品种[1]，可用枝条扦插繁殖，因其既耐热又抗寒的特性，一年四季均可开花结果。其果无核多汁，富含维生素，果实成熟后果皮黄绿色或淡黄色[2]。

有研究表明菌肥可以改善土壤环境，影响土壤微生物数量和土壤酶活力，培肥地力，提高肥料利用率，促进植物生长，增强抗性，减少病虫害发生[3-4]。

微生物是土壤生态系统的重要组成部分，参与土壤有机质的分解、碳氮循环以及成土过程，影响植物对矿质营养的吸收释放。土壤微生物会间接影响土壤肥力与植物营养。微生物分泌的土壤酶在土壤生态系统中起着关键作用，另外土壤酶还来源于植物根系及其残体、土壤动物及其遗骸，能催化土壤中复杂的有机物质转化为简单的无机化合物，供植物再利用[5]。土壤酶活性作为反映土壤中各种生物化学过程的方向和强度的指标[6]，参与了有机质分解、养分循环等重要机制。其中土壤过氧化氢酶、蔗糖酶、脲酶活性对评价土壤肥力水平起着重要作用[7]。

该研究以在无籽青柠檬种植地施不同肥料为研究对象，利用微生物纯培养技术和Biolog-ECO 技术分析施肥后土壤可培养微生物及其群落功能多样性以及土壤酶活性[8-9]，以期为无籽青柠檬的施肥管理提供理论基础，推动无籽青柠檬高产、绿色环保的种植方式的发展。

1 材料与方法

1.1 供试材料

台湾无籽青柠檬种苗为市售，种苗主杆统一定杆株高为25cm，地径0.8cm～1.2cm。

菌肥是以废弃菌糠和鸡粪为基质，按1：1 充分混匀，添加1%的腐熟菌剂初发酵21d 后，添加0.5%的功能菌剂进行发酵制成。菌糠主要填充物为橡胶木屑和麸皮。

1.2 试验地概况

试验于2017 年～2018 年分别在定安龙州、琼山三门坡和儋州木棠基地进行，柠檬园为缓坡地。3个样地基本概况如表1 所示。

1.3 试验方法

1.3.1 无籽青柠檬种植地施肥量设置

每个试验地划分为2 个相等的小区，每个小区30m2～50m2，分别进行施肥组和未施肥组的对比试验，菌肥与普通肥的对比，定安龙州基地与琼山三门坡基地、儋州木棠新北岸基地对比，每个处理重复3个。菌肥组按不同施肥量2kg/m2、4kg/m2、6kg/m2，普通肥按田间常规施肥量2kg/m2，分别在2018 年4月、6 月、8 月重复3 次施肥，另外设计不施肥作为对照处理。

1.3.2 土壤样品的采集

每个小区采用“S”形取样法采取5 点土样，土样深度5cm～10cm。装入贴好对应标签的无菌袋，带回实验室保存于4℃冰箱待用，于当天分析土样[1]。

1.3.3 土壤可培养微生物的测定

参考林先贵分离纯化培养土壤微生物的方法，采用常规涂布平板分离计数法测定土壤中可培养微生物[8]。

1.3.4 Biolog- ECO 测定

（1）Biolog-ECO 样品的处理及测定

参考章家恩等方法[9]，称取5g 鲜土加入装有100mL 的0.85%NaCl 灭菌生理盐水的三角瓶中，120r/min 振荡培养30min，冰浴中静置2min；取5mL上清液加入到装有45mL 无菌水的三角瓶中摇匀稀释，重复稀释2 次，制得1：100 的悬浊液用于ELSIA反应；吸取150μL 悬浊液滴入已预热的Biolog ECO 平板孔中，28℃恒温避光培养9d；每隔24h 用Biolog 读数器读取590nm 和750nm 的吸光值[10]。（2）土壤微生物群落功能多样性指数

平均吸光值(AWCD)是反映微生物群落活性的有效指标，其变化率和最终值可以反映土壤微生物群落利用碳源进行代谢的总能力[11]。计算公式为：AWCD=∑(Ci-R)/n，式中Ci为每个孔的吸光值，R 为对照孔的吸光值，n 为培养基碳源总数，此实验中n为31。

Shannon 指数(H’)可以表征群落中物种的丰富度，计算公式：H’=-∑Pi·ln(Pi)，Simpson 指数（D）表征最常见种的优势度，表现微生物对碳源利用多样性方面，更侧重对差异性的描述[13]，计算公式为：D=1-∑(Pi)2。上述两个式中：Pi为第i 个有培养基的孔和对照孔的光度值差与所有板总差的比值[12]。

McIntosh 指数（U）公式如下，式中：ni为第i 孔的相对吸光值[10]。

Pielou 指数（E）是通过Shananon-Wiener 指数计算出来的精度，指的是微生物群落实测多样性和最大多样性的比率，表征土壤微生物群落的均一性。计算公式如下：E=H’/lnS 式中：S 为被利用碳源总数[14]。

2 结果与分析

2.1 土壤肥效

从表2 中可以看出，定安龙州、琼山三门坡和儋州木棠基地种植的无籽青柠檬各施肥组的土壤pH、碱解氮、速效钾和速效磷含量均大于对照组，其中4kg/m2菌肥组土壤中的碱解氮、速效钾和速效磷含量最大， 定安龙州分别达 134.18mg/kg、146.57mg/kg、200.84mg/kg；琼山三门坡分别达160.43mg/kg、175.28mg/kg、205.67mg/kg；儋州木棠124.67mg/kg、140.68mg/kg、191.05mg/kg。另外，菌肥组土壤中的碱解氮、速效钾和速效磷含量整体随着菌肥量的增加呈现先增加后减少的趋势。定安龙州、琼山三门坡和儋州木棠4kg/m2菌肥组土壤的碱解氮、速效钾和速效磷比对照组分别提高32.6%、30.2%、14.8%；33.3%、16%、10.2%；33.4%、29.5%和22.2%。这一结果也充分说明施用菌肥有效提高了无籽青柠种植土壤的肥效，有利于无籽青柠檬的生长，同样有利于提高无籽青柠檬果的品质。

表2 不同施肥模式下土壤肥效Tab.2 Effects of different fertilization patterns on soil fertility

2.2 土壤可培养微生物

2.2.1 土壤微生物种类与总数

从表3 中可以看出，不同施肥模式下定安龙州基地种植的无籽青柠檬土壤中可培养微生物总数为4kg/m2菌肥组＞2kg/m2菌肥组＞2kg/m2普肥组＞6kg/m2菌肥组＞空白对照组，4kg/m2菌肥组土壤中可培养的细菌总数、放线菌总数和真菌总数均大于其他施肥组。该基地种植的无籽青柠檬施用菌肥后土壤中的可培养细菌总数、放线菌总数和真菌总数均随着施肥量的增加呈现先增加后减少的趋势；不同施肥模式下琼山三门坡基地种植的无籽青柠檬土壤中可培养微生物总数为6kg/m2菌肥组＞4kg/m2菌肥组＞2kg/m2普肥组＞2kg/m2菌肥组＞空白对照组，6kg/m2菌肥组土壤中的可培养细菌总数、放线菌总数大于其他施肥组，而4kg/m2菌肥组土壤中的真菌总数大于其他施肥组。该基地种植的无籽青柠檬施用菌肥后土壤中的可培养细菌总数随施肥量的增加而增加，真菌随施肥量的增加呈现先增加后减少的趋势，放线菌总数与施肥量的多少呈现不规则的变化；不同施肥模式下儋州木棠基地种植的无籽青柠檬土壤中可培养微生物总数为4kg/m2菌肥组＞6kg/m2菌肥组＞2kg/m2普肥组＞空白对照组＞2kg/m2菌肥组，4kg/m2菌肥组土壤中可培养的细菌总数、真菌总数均大于其他施肥组。该基地种植的无籽青柠檬施用菌肥后土壤中的可培养细菌总数、真菌总数随着施肥量的增加呈现先增加后减少的趋势，放线菌总数与施肥量的多少呈现不规则的变化。

表3 不同施肥模式下土壤中可培养微生物Tab.3 Culturable microorganisms in soil under different fertilization patterns

由表3 可见，就施肥量来看，定安龙州基地、琼山三门坡基地和儋州木棠基地无籽青柠檬地分别施用4kg/m2、6kg/m2、4kg/m2菌肥的土壤中的细菌和真菌总数最多，最有利于土壤有机和无机质的转化，能更好的参与土壤有机质分解与腐殖酸合成，直接影响土壤肥力，同时有利于氨化作用。另外，定安龙州基地、琼山三门坡基地和儋州木棠基地无籽青柠檬地分别施用4kg/m2、6kg/m2、6kg/m2菌肥的土壤中的放线菌最多，有利于提高土壤形成抗生物质的能力，对无籽青柠檬的病虫害防治具有重要的意义。

2.2.2 土壤微生物平均吸光值（AWCD）变化特征

从图1 看出，每隔24h，连续9d 测得的吸光值平均变化率随着培养时间的延长而提高，不同施肥组土壤微生物均在开始的24h 没有明显变化，即24h以内土壤微生物活性较低；而在48h～168h 内快速升高，随后持续缓慢地升高至试验结束。平均吸光值(AWCD) 总体变化趋势6kg/m2菌肥组＞4kg/m2菌肥组＞2kg/m2菌肥组＞2kg/m2普肥组＞空白对照组。

图1 不同施肥模式下土壤微生物平均吸光值Fig.1 Average absorbance of Soil Microorganism under different fertilization modes

2.2.3 土壤微生物利用不同碳源的变化特征

从图2 可以看出，随着时间的推移，不同施肥组土壤微生物对6 类碳源的利用越来越高。从整体趋势来看，不同施肥组的土壤微生物对碳水化合物碳源、氨基酸类碳源、多聚物、羧酸碳源利用均为4kg/m2菌肥组＞6kg/m2菌肥组＞2kg/m2菌肥组＞2kg/m2普肥组＞对照组。对酚酸类碳源的利用为6kg/m2菌肥组＞2kg/m2菌肥组＞空白对照组＞4kg/m2菌肥组＞2kg/m2普肥组；对胺类碳源的利用利用为6kg/m2菌肥组＞2kg/m2菌肥组＞4kg/m2菌肥组＞2kg/m2普肥组＞空白对照组。不同施肥组土壤微生物对6 大类碳源利用情况的的不同，说明不同施肥组土壤中的微生物群落结构、种类和数量均存在差异，导致不同样地的土壤微生物多样性不同。

图2 不同施肥模式下土壤微生物利用碳源情况Fig.2 Carbon source utilization by soil microorganisms under different fertilization patterns

2.2.4 土壤微生物群落功能多样性指数

从图3 可以看出，不同处理土壤微生物在培养168h 的McIntosh 指数(U 值)总体趋势均为4kg/m2菌肥组＞6kg/m2菌肥组＞2kg/m2菌肥组＞空白对照组＞2kg/m2普肥组，各施肥组的U 值差异显著，其中4kg/m2施肥组和6kg/m2施肥组与其他施肥差异极显著。不同施肥组土壤微生物在培养168h 的H’值、D 值和E 值差异不显著。

图3 不同施肥模式下土壤微生物多样性指数Fig.3 Soil microbial diversity index under different fertilization patterns

2.3 土壤酶活性

从表4 中可以看出，定安龙州施用6kg/m2菌肥组土壤中的蔗糖酶、多酚氧化酶和过氧化氢酶含量均大于其他施肥组，施用2kg/m2菌肥组土壤中的脲酶均大于其他施肥组。从不同施肥方式下的土壤中蔗糖酶含量指标来看，6kg/m2菌肥组＞2kg/m2普肥组＞2kg/m2菌肥组＞4kg/m2菌肥组＞空白对照组；脲酶含量指标2kg/m2菌肥组＞6kg/m2菌肥＞空白对照组＞4kg/m2菌肥组＞2kg/m2普肥组；多酚氧化酶含量指标6kg/m2菌肥组＞2kg/m2菌肥组＞2kg/m2普肥组＞4kg/m2菌肥组＞空白对照组；过氧化氢酶含量指标6kg/m2菌肥组＞2kg/m2普肥组＞2kg/m2菌肥组＞空白对照组＞4kg/m2菌肥组。由此可见，土壤中与土壤肥力关系密切的过氧化氢酶、过氧化物酶、多酚氧化酶、蔗糖酶与施肥量间的规律不明显。

由于琼山三门坡基地和儋州木棠基地施肥晚于定安龙州基地，土壤酶活性指标分析时，仅采集了施用4kg/m2菌肥组的土壤进行比较分析。结果表明琼山三门坡施用4kg/m2菌肥土壤中的酶含量脲酶＞蔗糖酶＞过氧化氢酶＞多酚氧化酶，儋州木棠基地施用4kg/m2菌肥土壤中的酶含量脲酶＞多酚氧化酶＞过氧化氢酶＞蔗糖酶。无籽青柠檬盆栽样品的处理盆栽土施用4kg/m2菌肥土壤中的酶含量脲酶＞蔗糖酶＞多酚氧化酶＞过氧化氢酶。

表4 不同施肥模式下土壤酶活性Tab.4 Soil enzyme activities under different fertilization patterns

3 结论与讨论

3.1 施用菌肥对土壤可培养微生物和肥效的影响

从目前定安龙州、琼山三门坡和儋州木棠基地试种无籽青柠檬不同施肥方式下的土壤中可培养微生物（细菌、真菌、放线菌）的分析结果来看，无籽青柠檬施用4kg/m2～6kg/m2菌肥有利于土壤中微生物的生长和代谢，有利于改善土壤结构，能更好的参与土壤有机质分解与腐殖酸合成，促进土壤腐殖质的生成，直接影响土壤肥效，增加植物抗性、促进植物对养分的吸收、减少病原危害，对无籽青柠檬的生长和病虫害的防治，以及无籽青柠檬果的品质具有重要的作用。

3.2 施用菌肥对土壤微生物多样性指数的影响

从目前定安龙州、琼山三门坡和儋州木棠基地试种无籽青柠檬不同施肥方式下的土壤中多样性指数的分析结果来看，4kg/m2施肥组的McIntosh 指数(U 值) 显著高于其他施肥组，各施肥组的Shananon-Wiener 指数(H’值)、Simpson 指数(D 值)和Pielou 均匀度指数(E 值)差异不显著。说明施用菌肥可以调节土壤微生物多样性的指数，但对各指数的调节效应不同。从研究的土壤中微生物多样性指数来看，无籽青柠檬施用4kg/m2菌肥对土壤中微生物的McIntosh 指数(U 值)调节最佳，有利于无籽青柠檬的生长。

3.3 施用菌肥对土壤酶活性的影响

从目前定安龙州、琼山三门坡和儋州木棠基地试种无籽青柠檬不同施肥方式下的土壤中酶活性（蔗糖酶、脲酶、多酚氧化酶、过氧化氢酶）的分析结果来看，施用6kg/m2菌肥试验组的土壤中的4 种酶活性整体优于其他试验组。这说明无籽青柠檬施用6kg/m2菌肥有利于提高土壤中几种关键酶的活性，对无籽青柠檬的生长具有重要的作用。