HBV前C区及基因启动子区基因变异与乙肝肝硬化相关性初步研究

魏芳芳?李文莉?甄丽敏?廖常斌?许瑞荣?吴茂盛

【摘要】目的 探讨HBV前C（PC）区和基本核心启动子（BCP）区与乙型肝炎患者病情进展的关系。方法 选择37例慢性乙型肝炎患者（慢乙肝组）及27例乙型肝炎肝硬化患者（肝硬化组），分析2组患者的一般资料和临床特征，对2组患者血清样本进行A1762T/G1764A、G1896A基因突变检测，比较组间差异。结果 肝硬化组患者的年龄大于慢乙肝组，ALT、HBV DNA水平低于慢乙肝组，层粘连蛋白水平高于慢乙肝组（P均< 0.05）。肝硬化组患者A1762T/G1764A双位点突变发生率为78%，高于慢乙肝组的49%（P < 0.05）;肝硬化组G1896A突变发生率为48%，慢乙肝组为60%，2组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。结论 乙肝肝硬化患者HBV PC/BCP区A1762T/G1764A突变率高于慢乙肝患者，A1762T/G1764A突变可能参与慢乙肝发展至肝硬化的过程。

【关键词】慢性乙型肝炎;乙肝肝硬化;前C区突变;基本核心启动子区突变

Preliminary analysis of correlation between gene mutation in pre-core and basic core promoter of hepatitis B virus and hepatitis B-induced liver cirrhosis Wei Fangfang， Li Wenli， Zhen Limin， Liao Changbin， Xu Ruirong， Wu Maosheng. Department of Infectious Disease， Guangdong Second Provincial General Hospital， Guangzhou 510317， China

Corresponding author， Wu Maosheng， E-mail： wu.maosheng@ 163. com

【Abstract】Objective To explore the correlation between the gene mutations in hepatitis B virus （HBV） pre-core （PC） and basic core promoter （BCP） and the progression of hepatitis B. Methods A total of 37 patients with chronic hepatitis B （CHB） and 27 patients with CHB-induced liver cirrhosis were recruited into the CHB and liver cirrhosis groups. Baseline data and clinical characteristics were analyzed in two groups. The gene mutations of A1762T/G1764A and G1896A in the serum samples were detected and compared between two groups. Results The age of liver cirrhosis patients was significantly older， the ALT and HBV DNA levels were considerably lower and the laminin level was significantly higher compared with those in the CHB group （all P < 0.05）. The incidence rate of of A1762T/G1764A double mutations in the liver cirrhosis group was 78%， significantly higher than 49% in CHB patients （P < 0.05）. The incidence rate of G1896A mutation did not significantly differ between the CHB and liver cirrhosis groups （60% vs. 48%， P > 0.05）. Conclusions The prevalence of A1762T/G1764A double mutations in the PC/BCP of patients with liver cirrhosis is significantly higher than that in CHB patients. A1762T/G1764A mutation probably participates in the progression from CHB into liver cirrhosis.

【Key words】Chronic hepatitis B;Hepatitis B-induced liver cirrhosis;Pre-core mutation;

Basic core promoter mutation

HBV前 C （PC）區和基本核心启动子（BCP）区基因变异后病毒复制能力增强、机体免疫原性改变和致病性增强，影响机体的免疫应答情况，使HBV逃避宿主的免疫清除，导致持续感染并加重肝细胞损害[1]。PC/BCP区基因变异是导致HBV感染病情加重的重要原因。PC/BCP区最常见突变位点是G1896A、A1762T/G1764A，既往研究表明G1896A、A1762T/G1764A突变会加重乙型肝炎患者病情，导致重型肝炎、肝癌的发生[2]。然而，有关PC/BCP区突变与肝硬化相关性研究却很少报道，本研究通过对慢性乙型肝炎（慢乙肝）与乙型肝炎肝硬化（乙肝肝硬化）患者G1896A、A1762T/G1764A发生率进行比较，进一步探索PC/BCP区突变在乙型肝炎病情进展中作用。

对象与方法

一、研究对象

选择2015年9月至2016年3月在我院住院治疗的37例慢乙肝患者（慢乙肝组）和27例乙肝肝硬化（肝硬化组）患者，其诊断均符合《2012亚太肝病研究学会共识声明：慢性乙型肝炎的治疗》的相关标准。全部患者HBV DNA均为超过105

IU/ml，既往均未接受过核苷（酸）类似物、IFN抗病毒或免疫调节治疗。排除标准：妊娠期或哺乳期妇女，重叠甲型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎或HIV感染患者，合并自身性免疫性疾病患者，肿瘤患者，合并酒精性肝病患者，合并脂肪肝患者，有其他严重全身性疾病患者。所有患者均对研究知情并签署知情同意书。

二、方 法

使用日本强生公司AU640型全自动生化仪检测生化指标。正常参考值范围：ALT 0 ～ 50 U/L，

AST 0 ～ 50 U/L，总胆红素0 ～ 20 μmol/L，凝血酶原活动度（PTA）75% ～ 100%，甲胎蛋白0 ～ 7 μg/L，

透明质酸0 ～ 100 μg/L，层粘连蛋白0 ～ 130 μg/L，

Ⅲ型前胶原0 ～ 130 μg/L，Ⅳ型胶原 0 ～ 85 μg/L。

HBV DNA采用荧光定量PCR法，由湖南圣湘生物科技有限公司提供试剂盒，检测下限102 IU/ml。

HBV基因突变采用扩增阻滞突变系统技术（ARMS）联合PCR检测BCP区A1762T/G1764A双位点变异及PC区G1896A变异，试剂盒由武汉百态基因有限公司提供，所有实验步骤均严格按照试剂盒说明书操作。分析2組患者的一般资料及临床特征，比较A1762T/G1764A及G1896A突变检测结果的组间差异。

三、统计学处理

应用SPSS 13.0进行统计分析，符合正态分布的计量资料以表示，组间比较采用t检验;不符合正态分布的计量资料以中位数（下四分位数，上四分位数）表示，组间比较采用秩和检验。计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ2检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

结果

一、慢乙肝组和肝硬化组的一般资料及临床特征比较

肝硬化组患者的年龄大于慢乙肝组，ALT、HBV DNA水平低于慢乙肝组，层粘连蛋白水平高于慢乙肝组（P均 < 0.05），见表1。

二、慢乙肝组和肝硬化组患者的A1762T/G1764A、G1896A突变检测结果比较

肝硬化组患者A1762T/G1764A双位点突变发生率高于慢乙肝组（P < 0.05），2组的G1896A突变发生率比较差异无统计学意义（P > 0.05），见表2。

讨论

原发性肝癌在我国常见恶性肿瘤中高居第四位，其在肿瘤致死病因中也位列第三，HBV感染是导致肝癌最主要因素。肝癌发生机制有关病毒方面的因素包括：病毒基因型、病毒载量、病毒基因突变等[3-4]。

G1896A、A1762T/G1764A是HBV PC/BCP区中最常见的基因变异类型，其变异可使HBeAg的产量减少，引起HBV的免疫逃逸，使HBV在体内长期持续活跃复制，并加重肝炎病情[5]。既往研究指出，PC/BCP区基因突变与肝癌发生密切相关。与慢乙肝患者相比，肝癌患者G1896A、A1762T/G1764A突变率明显增高[6]。然而，目前较少研究者关注G1896A、A1762T/G1764A突变与肝炎肝硬化间关系。为此，本研究通过比较慢乙肝组与肝硬化组患者PC/BCP突变发生率，初步探索PC/BCP区基因突变在乙肝患者病情进展中的作用。

本研究显示，肝硬化组患者A1762T/G1764A突变率高于慢乙肝组患者，提示A1762T/G1764A突变参与慢乙肝发展至肝硬化过程，可能机制有：①免疫耐受因子HBeAg合成和分泌的减少，导致免疫逃逸，进而影响细胞毒性T淋巴细胞介导的肝细胞杀伤;②影响肝细胞内核心颗粒的转运和包装，大量衣壳蛋白在细胞内蓄积，由胞核型转化为胞浆分布，可能增强细胞毒性T淋巴细胞的细胞毒活性，激发细胞因子释放或抗体依赖性细胞毒活性;③改变被感染肝细胞表面HLA分子提呈的病毒衣壳蛋白组成，进而激发一系列的T淋巴细胞反应致肝细胞损伤加重[7]。既往研究显示，A1762T/G1764A基因突变仅增加了肝硬化发生率，与肝癌发生无关[8]。本研究显示肝硬化组患者A1762T/G1764A突变发生率高于慢乙肝组，A1762T/G1764A是否通过增加肝硬化发生率从而导致肝癌发生仍需进一步研究验证。本研究亦提示，A1762T/G1764A基因突变与肝癌相关性的研究应在排除肝硬化混杂因素下进行。

G1896A可通过诱导终止密码子产生从而减少HBeAg产生，尽管HBeAg产生减少，但HBV仍在活跃复制，进而加重慢乙肝患者病情[9]。既往研究显示，肝癌患者G1896A突变发生率升高[6]。然而本研究显示肝硬化组患者G1896A突变发生率与慢乙肝组比较差异无统计学意义，提示G1896A可能直接与肝癌发病机制相关，有关机制需要进一步研究证实，未来仍需要加大样本量验证。

综上所述，乙肝肝硬化患者HBV PC/BCP区A1762T/G1764A突变率高于慢乙肝患者，A1762T/G1764A突变可能参与慢乙肝发展至肝硬化过程，具体机制仍需要进一步研究。本研究存在的不足之处：第一，样本量偏小，未来仍需较大样本进一步证实;第二，未对病毒进行基因型检测，无法去除基因型混杂因素影响。

参 考 文 献

[1] Chachá SGF， Gomes-Gouvêa MS， Malta FM， Ferreira SDC， Villanova MG， Souza FF， Teixeira AC， Passos ADDC， Pinho JRR， Martinelli ALC. Basal core promoter and precore mutations among hepatitis B virus circulating in Brazil and its association with severe forms of hepatic diseases. Mem Inst Oswaldo Cruz， 2017， 112（9）：626-631.

[2] Meier-Stephenson V， Bremner WTR， Dalton CS， van Marle G， Coffin CS， Patel TR. Comprehensive analysis of hepatitis B virus promoter region mutations. Viruses， 2018， 10（11）：603.

[3] Mukaida N， Nakamoto Y. Emergence of immunotherapy as a novel way to treat hepatocellular carcinoma. World J Gast-roenterol， 2018， 24（17）：1839-1858.

[4] Daher S， Massarwa M， Benson AA， Khoury T. Current and future treatment of hepatocellular carcinoma： an updated comprehensive review. J Clin Transl Hepatol， 2018， 6（1）：69-78.

[5] Hu F， Bi S， Yan H， Shi Y， Sheng J. Associations between hepatitis B virus basal core promoter/pre-core region mutations and the risk of acute-on-chronic liver failure： a meta-analysis. Virol J， 2015， 12：87.

[6] Wei F， Zheng Q， Li M， Wu M. The association between hepatitis B mutants and hepatocellular carcinoma： a meta-analysis. Medicine （Baltimore）， 2017， 96（19）：e6835.

[7] Tseng TC， Liu CJ， Yang HC， Chen CL， Yang WT， Tsai CS， Kuo SF， Verbree FC， Su TH， Wang CC， Liu CH， Chen PJ， Chen DS， Kao JH. Higher proportion of viral basal core promoter mutant increases the risk of liver cirrhosis in hepatitis B carriers. Gut， 2015，64（2）：292-302.

[8] Quarleri J. Core promoter： a critical region where the hepatitis B virus makes decisions. World J Gastroenterol， 2014，20（2）：425-435.

[9] Kim H， Lee SA， Do SY， Kim BJ. Precore/core region mutations of hepatitis B virus related to clinical severity. World J Gastr-oenterol， 2016，22（17）：4287-4296.

（收稿日期：2019-10-25）

（本文編辑：林燕薇）