肝脏疾病的外泌体治疗研究进展

冯帆 江梅 邵勇

作者单位：400016 重庆医科大学附属第一医院妇产科(冯帆，邵勇)；四川省内江市第一人民医院妇产科(江梅)

肝脏疾病的治疗方法较多，但许多慢性肝病仍然无法彻底根治。药物治疗无效时进入终末期的肝脏疾病临床上常常会选择肝脏移植等手段，但也面临很多问题，所以急需新的肝病治疗方法。

近年来，外泌体(Exosome)的研究引起了医学界的广泛关注。 1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现。外泌体是由多种免疫细胞、上皮细胞和肿瘤细胞产生的一种特殊类型的微泡，在多囊体(MVB)内产生，并在MVB与质膜融合之后释放[1]。外泌体具有脂质双分子层结构，外泌体中含有丰富的蛋白质、核酸、mRNA和miRNA，而且具有信号传递的功能。目前许多研究显示，外泌体参与多种疾病的发生、发展，并可能用于疾病的治疗。本文将外泌体用于肝病治疗方面的近年研究进展综述如下。

一、肝脏缺血再灌注损伤(IRI)的外泌体治疗

肝脏缺血再灌注(IRI)损伤一般发生在创伤性休克，肝脏手术或肝移植术后。当缺血组织重新获得血液供应时，器官功能不但不能恢复，反而会加重功能代谢障碍及结构破坏，这主要是由于恢复血液供应后，过量的自由基攻击了重新获得血液供应的组织内的细胞造成的。

目前肝脏IRI的主要防治方法为缺血预处理(IPC)。此方法虽然处理简单且无药物副作用，但预处理的条件和程度却不易控制。因此，必须寻求新的治疗方法。

目前研究显示，用于肝脏损伤治疗来源最多的就是间充质干细胞(MSC),因为MSC具有强大的分化和转分化的能力。Nong等[3]将多能干细胞来源的间充质基质细胞产生的外泌体(hiPSC-MSCs-Exo)注射到大鼠肝脏I/R损伤模型中，与对照组相比，Exo+I/R组肝细胞坏死和肝窦充血明显受到抑制，再灌注后AST，ALT降低，巨噬细胞和中性粒细胞减少，MPO水平降低，血清肿瘤坏死因子-a和IL-6水平降低，且凋亡蛋白capspase-3细胞数降低而抗凋亡蛋白Bcl-2升高。这些数据都显示hiPSC-MSCs-exo具有抗炎且诱导肝细胞的抗凋亡作用。

Sun等[4]研究显示用褪黑素预处理的MSCs衍生的外泌体比单独注射外泌体处理成年大鼠后在抑制炎症，降低氧化应激及减少凋亡蛋白方面效果更好。

二、药物肝损伤的外泌体治疗

药物性肝损伤(drug-induced liver injury，DILI)是指在药物的临床应用过程中由各类化学药物、生物制剂、传统中药(TCM)、天然药(NM)、保健品(HP)、膳食补充剂(DS)及其代谢产物乃至辅料等所诱发的肝损伤，已知全球有1 100多种上市药物具有潜在肝毒性[5]。目前，外泌体在药物性肝损伤(DILI)的治疗上已取得了一些进展。

(一)胚胎干细胞来源的外泌体治疗药物肝损伤 Tan等[6]将胚胎干细胞中提取出来的外泌体与CCl4腹腔注射给小鼠，用CCl4和外泌体处理的小鼠AST和ALT增加小于对照组且仅发现微量坏死细胞。在体外用乙酰氨基酚(APAP)和过氧化氢(H2O2)诱导肝损伤来测定外泌体对细胞活力的影响，在两种损伤模型中外泌体处理组细胞活性显著高于未处理组。外泌体处理组增殖细胞核抗原PCNA和增殖蛋白cyclinD1和cyclinE的肝脏基因表达显著上调，显示出外泌体的增殖和再生作用。外泌体还通过上调Bcl-xL蛋白表达抑制APAP和H2O2诱导的肝细胞凋亡。

(二)骨髓间充质干细胞来源的外泌体治疗药物肝损伤 Tamura等[7]从C57B6小鼠骨髓MSC中收集外泌体，静脉注射到刀豆蛋白-A(ConA)诱导小鼠肝损伤模型中，显示ALT水平降低且坏死区域减少，促炎细胞因子IL-2降低，转化生长因子b和肝细胞生长因子表达增加。单链DNA(ssDNA)是凋亡细胞的标记，只有注射三次外泌体小组观察到ssDNA指数的降低。另外，接受三次注射的小鼠组与MSCs在抑制肝损伤的程度上相似。注射外泌体和MSCs组都有Treg数量增加，但注射三次外泌体小组Treg数量百分比最高。外泌体也对诱导的肝损伤有抑制作用，且多次注射外泌体的实验组中Treg数量增加。

(三)肝细胞来源的外泌体治疗药物肝损伤 Nojima等[8]研究发现只有原代肝细胞来源的外泌体能促进肝细胞增殖，库普弗细胞来源的外泌体降低了肝细胞增殖。

三、肝纤维化的外泌体治疗

肝纤维化 (hepaticfibrosis) 是指肝脏内弥漫性的纤维结缔组织沉积，是对炎症坏死等组织损伤的修复反应。引起肝纤维化常见的疾病包括病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、胆汁淤积性肝病、自身免疫性肝病等。胆汁淤积(cholestasis)是由于胆汁分泌及排泄障碍引起的一种病理生理过程，，长期持续的胆汁淤积将进展为肝纤维化或肝硬化。目前还没有特异有效的治疗肝纤维化的办法，治疗的主要目的就是阻止肝脏损伤，延缓进一步恶化的进程。临床上只能针对原发病和抗纤维化进行治疗。

(一)脐带间充质干细胞来源的外泌体治疗肝纤维化 Li等[9]用CCL4诱导小鼠肝纤维化，将人脐带间充质干细胞来源的外泌体(uMSC-Ex)注入小鼠肝脏后显示I型胶原和III型胶原的表达减少，AST维持在正常水平而对照组AST显著提高，ALT则与对照组无差异，血清HA降低，血清TGF-b1降低，TGF-b1可以激活Smad2的磷酸化，并在体内导致肝脏EMT。曾韬等[10]通过超速离心收集uMSC-Ex，用双氧水处理肝细胞系L02和WRL-68建立肝细胞损伤模型，25ng/ml的TGF-b1加0.75mM的ATP刺激肝星状细胞作为LX2活化模型。结果发现在肝损伤模型中uMSC外泌体能上调肝细胞中凋亡蛋白Bcl-2的表达和减少肝细胞的凋亡，在LX-2激活模型中，加入uMSC外泌体能减少a-SMA的表达。利用特异性的唾液酸糖苷酶从外部将外泌体a-2，6-唾液酸糖结构切除后，再将酶切后的外泌体进行实验，发现酶切后的外泌体失去作用。说明外泌体中糖蛋白a-2，6-唾液酸糖结构对外泌体的生物学作用有很大影响。

(二)脂肪间充质干细胞来源的外泌体治疗肝纤维化 Lou等[11]通过慢病毒介导的前miR-122转移构建了MIR-122修饰的脂肪来源间充质干细胞(AMSC-122)，腹腔注射到CCL4诱导的小鼠肝纤维化模型中，显示AMSC-122抑制胶原合成和成熟，抑制肝星状细胞(HSC)的增殖，血清HA、P-III-P、ALT、AST和肝羟脯氨酸含量降低，Col1A1蛋白水平降低，TGF-b1和a-SMA表达水平下调。Qu等[12]也发现外泌体可以作为载体将miR-181-5p传递给HSC-T6，来自miR-181-5p-ADSCs的外泌体下调HSC-T6细胞中STAT3和Bcl-2的表达并激活自噬。与对照组相比，外泌体治疗减轻了肝脏损伤，下调了肝脏中的I型胶原、波形蛋白、a-SMA和纤维连接蛋白。

(三)骨髓间充质干细胞来源的外泌体治疗肝纤维化 Rong等[13]用人骨髓间充质干细胞来源的外泌体(HBM-MSCs-Ex)治疗小鼠肝纤维化模型，发现HBM-MSCs-Ex治疗组胶原面积低于HBM-MSCs治疗组，同样Ishak纤维化评分，IL-6,IL-1,羟脯氨酸和丙二醛水平也低于HBM-MSCs治疗组，说明HBM-MSCs-Ex的治疗效果明显大于HBM-MSCs，两治疗组均能降低血清AST,ALT,总胆红素，碱性磷酸酶和g-GT水平。

四、肝衰竭的外泌体治疗

肝衰竭是由多种因素引起的严重肝脏损害, 导致合成、代谢、解毒和生物转化功能严重障碍或失代偿, 出现以黄疸、凝血功能障碍、腹水、肝肾综合征、肝性脑病等为主要表现的一组临床症候群。

(一)脂肪间充质干细胞来源的外泌体治疗肝衰竭 Liu等[14]用AMSC-Ex治疗ALF小鼠模型发现有明显的治疗效果，而将miR-17敲除后的AMSC-Ex治疗效果被取消，说明miR-17在治疗ALF中发挥重要作用。miR-17通过靶向TXNIP，减少巨噬细胞中NLRP3的炎症小体活化，改善GalN/TNF-α诱导的ALF，从而对ALF产生保护作用。王皙等[15]发现AMSC-Ex对ALF小鼠模型有明显的治疗作用，RNA测序发现肝组织内与炎症反应及趋化因子信号通路相关多种基因显著下调，从六种miRNAs中筛选出来对抑制炎症及趋化因子途径最明显的miR-19b-3p，miR-19b-3p靶作用于P47phox-ROS抑制活化巨噬细胞内炎症促进性细胞因子IL-1a、IL-6、TNF-a，促进炎症抑制性因子IL-10的表达。

(二)脐带间充质干细胞来源的外泌体治疗肝衰竭 Jiang等[16]将脐带间充质干细胞提取的外泌体用PHK67标记，与巨噬细胞共孵育，在巨噬细胞中发现荧光，表示外泌体可以被小鼠体内巨噬细胞吸收，结果显示uMSCs-Ex降低脂多糖刺激的RAW-264.7巨噬细胞中的NLRP3和caspase-1、IL-1b和IL-6的表达，逆转ALF导致的肝脏病理改变和炎性细胞浸润，AST和ALT也显著降低。

(三)月经血干细胞来源的外泌体治疗肝衰竭 Chen等发现[17]人月经血源性干细胞来源的外泌体(MenSC-Ex)可以减少体外AML12细胞(一种小鼠肝细胞系)的凋亡，也减少LPS/D-GalN诱导的暴发性肝功能衰竭(FHF)小鼠模型中肝脏单核细胞(MNC)和活性凋亡蛋白caspase-3的数量，具有抗凋亡的作用。

五、肝脏肿瘤的外泌体治疗

研究显示，中国每年超过30万人死于肝细胞癌，占全球肝癌死亡人数的一半，肝移植是全球公认的最有效办法之一[18]，但肝脏需求远远大于供肝数量。

(一)脂肪间充质干细胞来源的外泌体治疗肝脏肿瘤 Lou等[19]用miR-122转染AMSC，提取出来的122-Exo可以改变miR-122-靶基因的表达使癌细胞对化疗药物敏感，瘤内注射122-Exo可以显著提高索拉菲尼在体内对HCC的抗肿瘤效果，增强HCC化疗敏感性。

(二)肝细胞来源的外泌体治疗肝脏肿瘤 Cheng等[20]发现肝细胞来源的含有p120ctn(一种在许多实体肿瘤中异常表达的膜蛋白)的exosome通过STAT3途径抑制HCC细胞的进展。Cheng等[21]用褪黑素处理肝癌来源的外泌体(Exo-MT)，发现处理后的外泌体可以通过STAT3途径减弱肿瘤细胞导致的巨噬细胞的免疫抑制状态。Lin等[22]从转染pEGFP-C3-NSMase1的L02细胞培养液中分离出exosome，发现NSMase活性增加，NSMase1-Exo通过降低鞘磷脂(SM)/神经酰胺(Cer)的比值抑制HCC细胞生长并诱导凋亡。Cho等[23]将暴露于醋氨酚(APAP)中的小鼠的外源性外泌体内化到小鼠肝细胞中或HepG2肝癌细胞中，发现可以显著降低受体细胞的活力。

(三)树突状细胞来源的外泌体治疗肝脏肿瘤 Lu等[24]将表达AFP的树突状细胞(DEXAFP)的外泌体注入HCC小鼠模型中，发现DEXAFP诱导了强烈的抗原特异性免疫反应，并导致异位、原位和致癌物诱导的具有抗原和病理异质性的肝癌小鼠明显的肿瘤生长迟缓和延长的存活率。表现为肿瘤部位表达c-干扰素(IFN-c)的CD8+T淋巴细胞明显增多，IFN-c和白细胞介素-2水平升高，CD25+Foxp3+调节性T(Treg)细胞减少，肿瘤部位白细胞介素-10和转化生长因子-b水平降低。

外泌体治疗肝病虽然已经有一定的进展，但目前尚停留在细胞实验和动物实验的阶段，临床应用还有一定的距离。随着外泌体研究的深入，外泌体提取和纯化技术的进步，未来外泌体必定能给肝病治疗领域带来新的希望。