血-视网膜屏障损伤的机制及治疗对策

李 敏，莫诗雯，李 伊，张全鹏,3

0 引言

血-视网膜屏障(blood-retina barrier，BRB)在维持视网膜微环境稳态中起重要作用，很多疾病如糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)、急性青光眼、早产儿视网膜病变等都会出现BRB损伤[1]。导致BRB损伤的相关因素很多，如缺血缺氧、氧化应激与活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的产生、炎症因子致炎作用以及强光持续刺激等，但是目前BRB损伤的机制仍不十分明确。尽管目前对BRB损伤的治疗有药物治疗、手术和激光等多种疗法，但尚没有根治BRB损伤的有效方法。因此，深入探究BRB损伤的发病机制并有效阻断BRB损伤的发生和发展，对伴有BRB损伤的相关眼病的诊疗具有重要的指导意义。

1 BRB的结构及功能

血眼屏障是血液与眼部的房水、晶状体和玻璃体等组织之间存在的屏障。BRB是血眼屏障的一个重要组成部分，它在体循环与视网膜环境之间形成屏障，在维持正常视网膜功能中起着重要作用[2]。BRB可分为外血-视网膜屏障(outer blood-retina barrier，oBRB)和内血-视网膜屏障(inner blood-retina barrier，iBRB) 两部分，其中oBRB由视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞及其连接构成，iBRB由视网膜血管内皮细胞及其连接、基底膜、周细胞和星形胶质细胞的突起共同构成[3]。

1.1 oBRBRPE位于感光视网膜和脉络膜的Bruch膜之间，兼具吞噬细胞、上皮细胞、色素细胞这三种细胞的功能[4]。RPE在其邻近感光细胞的代谢支持中起关键作用，并参与感光细胞外膜的生物更新[4]。另外RPE还能分泌抑制新生血管的色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)，使得PEDF与血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)达到动态平衡，而阻止脉络膜新生血管的发展[4-5]。RPE介导的BRB完整性缺失是糖尿病性黄斑水肿(diabetic macular edema，DME)的一个重要特征，而DME是DR引起的一种慢性病变[4]。

1.2 iBRB视网膜血管内皮细胞是覆盖在血管腔上的单层细胞，在血液循环和神经视网膜之间起着选择性屏障的作用，同时有效地为神经视网膜提供氧气和营养[6]。视网膜血管内皮细胞连接包括紧密连接(tight junctions，TJs)、黏附连接(adherens junctions，AJs)和缝隙连接(gap junctions，GJs)，三者共同形成复合体，调节细胞通透性和维持细胞极性，介导细胞间黏附和相互通讯[3]，维持视网膜局部微环境的稳定[6]。其中TJs是BRB最主要的连接结构，BRB正常功能的发挥主要依赖于血管内皮细胞间的TJs蛋白的完整性[3]。形成TJs复合体的蛋白包括多种蛋白如跨膜蛋白Claudins、Occludins、膜相关蛋白(如ZO-1、ZO-2、ZO-3)和TJs黏附因子等[7]。

此外，视网膜中的周细胞、星形胶质细胞、Müller细胞以及小胶质细胞对BRB发挥正常功能有着重要影响[6]。周细胞可调节视网膜毛细血管局部血流量及血管通透性，具有支持血管内皮细胞的作用，周细胞丢失会促进BRB破坏，增加血管通透性，导致血管源性黄斑水肿[8]。星形胶质细胞是存在于视网膜的神经胶质细胞，包裹着视网膜神经节细胞的轴突，形成轴突血管胶质鞘，这些细胞作为BRB的活跃部分，能够感知神经元功能变化，控制从血管到神经元的物质转移[6]。Müller细胞是视网膜中最丰富的胶质细胞，从视网膜下间隙延伸到玻璃体，是神经元与血管之间的解剖和功能连接支架，具有调节血管张力，维持BRB的完整性等重要作用[9]。小胶质细胞是负责维持大脑和视网膜内稳态的免疫细胞[10]，一般情况下，小胶质细胞不断地监视视网膜实质，具有分泌神经营养因子，吞噬细胞碎片和功能失调或无用的突触等作用[11]。

2 BRB损伤的机制

2.1 糖尿病视网膜病变DR为糖尿病(diabetes mellitus，DM)最常见的微血管并发症之一，是一种神经血管类疾病[12]。高血糖是引起糖尿病患者DR的主要原因。长期高血糖会导致糖尿病患者体内代谢紊乱以及全身微循环障碍，眼底视网膜血管容易受损，从而发生DR[13]。BRB的破坏是DR的特征性病理改变，表现为血流减少，白细胞淤滞，引起血管渗透性增加和病理性血管生成[12-14]。DR导致BRB损伤的主要环节包括：(1)高血糖会引起内皮细胞黏附蛋白的表达上调，促进白细胞和单核细胞停滞，引起血管障碍，凝血系统亢进，纤溶功能低下，视网膜毛细血管阻塞，从而可能导致血管内皮细胞功能障碍及死亡[15]；另有体外研究表明，高血糖会导致视网膜内皮细胞数量显著减少，引起血管生成和小动脉瘤的发生[16]。(2)促进线粒体ROS产生增加，并发生氧化应激损伤线粒体DNA，加速细胞凋亡[6]；ROS增加会导致炎症介质的产生和多种代谢途径的激活，如蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)途径、晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)途径、己糖胺途径和多元醇途径[6]，而PKC激活、氧化应激增强及AGEs增多等会破坏BRB结构和功能[17]。糖尿病患者视网膜ROS增加，抗氧化防御系统会受到损害，同时会刺激促炎因子的释放，导致慢性炎症的发生[6]。(3)造成视网膜缺血缺氧，导致视网膜内皮细胞损伤、微血管通透性增加以及炎症部位炎症细胞的聚集，促进DR的发生[6]。(4)视网膜炎症对DR的发生发展起重要作用[18]。DR时，机体内的炎症介质和细胞因子等物质可以在转录、翻译、翻译后修饰水平等不同阶段改变连接蛋白的结构并引起其功能障碍，也可直接损伤血管内皮细胞、周细胞和RPE细胞，最终引起细胞间隙增大，连接结构破坏，BRB通透性增加[18]，也可诱导RPE细胞异常分泌VEGF，从而导致内皮细胞损伤、BRB破坏和新生血管的生成[19-21]。VEGF是造成DR发生的促新生血管因子，也是一种促炎因子，它在调节视网膜新生血管生成方面具有关键作用[22-23]。VEGF可以降低紧密连接蛋白Occludin的表达[24]，且在高糖环境下Occludin蛋白的表达随着视网膜血管内皮细胞VEGF表达增加而下调[25]。在视网膜Müller细胞中，糖尿病可诱导启动IL-17RA/Act1/NF-κB信号系统和产生白介素(IL)-17A，Act1信号系统的激活和IL-17A的分泌是炎性反应的标志[12]。研究表明，外源性IL-17A可导致糖尿病诱导的Müller细胞的功能恶化和活动不良、BRB崩解和视网膜神经元的凋亡[12]，这加速了DR的进展。核转录因子(NF-κB)负责诱导各种常见的促炎细胞因子如IL-1p、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等的产生，它们在糖尿病患者或大鼠的玻璃体、视网膜及血清中的含量明显增加；TNF-α是视网膜血管系统中白细胞淤滞的有效介质之一，它的增加引起细胞间黏附分子-1(ICAM-1)上调以及紧密连接蛋白Occludin减少；而TNF-α和ICAM-1两者共同促进血管内皮细胞和周细胞的凋亡，最终导致BRB完整性的破坏[26]。(5)甲基乙二醛(methylglyoxal，MGO)是体内糖酵解产生的一种细胞毒性代谢物。研究发现DR患者MGO水平升高，而MGO的升高会激活基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)以及AGEs前体的表达，从而导致TJs蛋白表达减少，BRB通透性增加[27]。

因此，DR导致BRB损伤的机制为多因素、多环节共同作用的结果。高血糖导致缺血缺氧、氧化应激ROS产生增多、促炎因子或炎症介质的释放等环节介导视网膜内皮细胞损伤和TJs蛋白表达减少，是目前比较认同的DR中BRB破坏的机制，其中VEGF介导TJs蛋白改变在DR中BRB破坏的机制研究较多、较透彻。

2.2 急性青光眼急性高眼压动物模型是常用的急性青光眼动物模型，属于缺血缺氧实验动物模型[28]。视网膜缺血缺氧时，作为对缺氧敏感的核转录因子缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)会被激活[29]。在实验性青光眼中，眼压升高会引起HIF-1α及其靶基因表达上调[30]。研究发现，急性高眼压后HIF-1α的表达在早期明显上调，晚期逐渐恢复，其表达的时空特征与BRB损伤的时空特征一致，提示急性高眼压后HIF-1α的表达上调可能与BRB的损伤有关[31]。而诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、视网膜葡萄糖转运因子-1(glucose transporter-1，GLUT-1)和VEGF都是HIF-1α的下游分子[30]，可能在BRB损伤中起重要作用。研究表明，急性高眼压后iNOS的表达增加，分析可能是由于神经胶质细胞激活和NOS上调而导致视网膜和视神经损伤[32]。GLUT-1是葡萄糖通过BRB的唯一载体，急性高眼压后早期大鼠视网膜GLUT-1表达下调，严重影响了血液中的葡萄糖转运至视网膜细胞，视网膜神经细胞由于葡萄糖的缺乏而出现代谢紊乱，进而导致视网膜损伤[33]。VEGF是在生理和病理情况下血管生成过程中增加微血管通透性的主要因子[34]。VEGF-A是一种有效的血管生成因子，可诱导内皮细胞迁移、增殖、分化和再生[35]。VEGF-A是由8个外显子的选择性剪接产生的，由外显子8(外显子8a)近端剪接形成的促血管生成VEGF-Axxx和外显子8(外显子8b)远端剪切产生的抗血管生成VEGF-Axxxb。VEGF-A 165b可保护视网膜免受缺血损伤[36]。在实验性青光眼模型中，眼压升高可诱导VEGF表达上调的只是其中一个亚型VEGF-A 165b，其可以抑制血管生成，而另一个亚型VEGF-A 164可促进血管生成，表达水平并没有改变[37]。因此，VEGF在急性高眼压引起的BRB损伤中的作用尚存争议。而HIF-1α及其下游分子iNOS、GLUT-1和VEGF在急性高眼压引起的BRB损伤中的具体作用环节和作用机制仍不完全清楚，需进一步研究确定。

2.3 早产儿视网膜病变早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity，ROP)是一种发生于低出生体质量早产儿的视网膜血管异常增殖的严重致盲眼病[38]。目前有多种关于ROP的致病学说，包括VEGF、HIF-1、胰岛素样生长因子、促红细胞生成素(EPO)、一氧化氮氧化物、胎盘生长因子、腺苷、Apelin以及β-肾上腺素能受体(β-adrenergic receptors，β-ARs)的多效性和交感神经系统的作用[39]。用于研究ROP发病机制的动物模型常见的有氧诱导的视网膜病动物模型[40-42]，研究发现在氧诱导的视网膜病变中，常出现视网膜新生血管形成和BRB破坏，Caveolin-1[40]、Netrin-1[41]和VEGF[42]在其发病过程中起关键作用。其他如HIF-1、胰岛素样生长因子、一氧化氮氧化物、胎盘生长因子、腺苷等分子在氧诱导的视网膜病变BRB破坏过程中的具体作用机制尚需进一步研究。

2.4 其他视网膜经强光长时间照射后易引起光感受器层的光损伤，光感受器损伤的主要机制包括自由基和脂质过氧化物介导的氧化应激、凋亡相关因子的调节、细胞内钙水平升高和视紫红质介导的损伤[43]。光损伤会导致RPE的通透性增加，可能与VEGF信号途径有关。光损伤也会启动细胞凋亡程序，导致光感受器细胞进行性凋亡，外节膜盘不断脱落，RPE不断被吞噬，在超出其负荷时即出现视网膜色素细胞凋亡，继而引起iBRB和oBRB破坏[44-45]。

3 BRB损伤的治疗

3.1 药物治疗

3.1.1 抗VEGF药物目前常见的抗VEGF药物有贝伐单抗(Bevacizumab，商品名Avastin)、雷珠单抗(Ranibizumab，商品名Lucentis)、阿柏西普(Aflibercept，商品名VEGF Trap-Eye)，它们可与VEGF-A所有亚型结合并抑制其表达[13]。贝伐单抗和雷珠单抗均是VEGF特异性抗体，前者为重组人源化的全长单克隆IgG抗体，后者为单克隆抗VEGF抗体片段重组体。雷珠单抗较贝伐单抗有更好的视网膜穿透力和作用，但价格更高。阿柏西普是VEGF受体重组融合蛋白，与VEGF结合的亲和力是雷珠单抗的140倍[46]。但有研究报道部分增殖性糖尿病视网膜病变(PDR)患者玻璃体中VEGF水平不升高，在这些非VEGF应答者中，由于促炎细胞因子发挥了主要的病理作用，因此玻璃体腔内注射类固醇更为合适[47]。另外，有研究表明玻璃体腔内注射KH902(VEGF受体抑制剂)能够抑制糖尿病大鼠视网膜内皮细胞Occludin和Claudin-5水平下调，保护糖尿病大鼠iBRB的功能[48]。

3.1.2 皮质类固醇皮质类固醇通过多种机制产生抗炎作用[49]，包括炎症介质、VEGF合成减少。糖皮质激素玻璃体内治疗可抑制大鼠视网膜ICAM-1的表达，显著降低炎症反应，改善BRB功能[50]。研究认为，皮质类固醇在治疗DME中的应用可能比抗VEGF治疗更有效[51]。目前，可用于玻璃体腔内注射的皮质类固醇药物包括曲安奈德、地塞米松(Ozurdex)和氟辛诺酮(Iluvien)[47]。

3.1.3 促进紧密连接蛋白表达的潜在药物研究发现，七叶皂苷钠可能通过促进Occludin蛋白表达抑制ROCK信号通路，降低视网膜血管内皮细胞的通透性，稳定BRB功能，阻止DR的发生发展，具有改善大鼠DR的药效活性[14]。体外实验证明，多重激酶抑制剂阿西替尼(axitinib)可通过抑制低氧条件下内皮细胞Occludin及ZO-1的下调，从而缓解低氧诱导的人脐静脉内皮细胞渗漏性增加[52]。p38 MAPK信号通路激活可引起iBRB的渗漏及紧密连接蛋白的破坏，而核心蛋白多糖(decorin，DCN)可通过抑制p38 MAPK信号通路的激活实现对iBRB的保护作用[53]。人脐带间充质干细胞可以通过抑制NF-κB信号通路抑制TNF-α、ICAM-1及VEGF的表达，进而使Occludin蛋白表达增加，这对维持BRB的正常功能及在早期DR引起的血管病变中具有重要作用[54]。

3.1.4 其他Connexin 43可能通过依赖ATP释放/炎性小体通路激活的方式介导DME中发生的BRB破坏，抑制Connexin 43可使DME中的RPE免遭破坏，因此，Connexin 43是治疗DME的潜在治疗靶点[55]。Apelin-13可通过抑制小胶质细胞的活化和增殖、减少炎症介质的释放对氧诱导的视网膜病变模型鼠的BRB产生一定的保护作用[39]。枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharides，LBP)能显著减少ROS的生成，还可明显改善光感受器细胞由于光暴露所引起的损伤，这可能是由于LBP预处理可上调氧化基因Nrf2和TrxR1，清除氧自由基，进而减少线粒体对氧化应激的反应，增强抗氧化能力，从而有效保护光感受器细胞诱导的视网膜损伤[43]。

3.2 激光治疗激光的作用机制主要是破坏缺血视网膜，改善邻近视网膜区域的氧合，减少VEGF的产生，同时促进视网膜色素上皮细胞和Müller细胞释放细胞因子[47]。激光治疗DR是一种高度有效的眼内治疗手段，能预防糖尿病患者视力下降。激光治疗虽然本身具有破坏性，但在预防视力丧失和长期保持视力方面效果显著[56]。

3.3 手术治疗玻璃体切割术(pars plana vitrectomy，PPV)是近年发展较快的高新技术，现已逐渐由传统手术方式向微创甚至无创发展，常见的有23G、25G+ PPV术两种，是眼科治疗的突破。通过切除玻璃体可以祛除出血、清除病原微生物、取出眼内异物，为视网膜复位创造条件[57]。

4 小结与展望

HIF-1α及其下游分子在急性高眼压引起的BRB损伤中的具体作用机制仍不完全清楚，是目前学者比较感兴趣的研究方向。HIF-1、胰岛素样生长因子、一氧化氮氧化物、胎盘生长因子、腺苷等在氧诱导的视网膜病变BRB破坏过程中的具体作用机制目前尚不清楚，探讨上述分子在BRB损伤中的具体作用机制，并找出合适的抑制BRB损伤的药物，对于伴有BRB损伤的眼部疾病如急性青光眼、ROP的精准治疗具有较好的前景。目前关于BRB损伤有关的眼部疾病的治疗方法，由于VEGF在DR的BRB损伤中研究报道较多，作用机制研究较透彻，因此抗VEGF药物应用较广泛。对于病情较轻的患者一般采用其中一种或两种治疗方法即可，而对于病情较重的患者，抗VEGF药物与全视网膜光凝术(panretinal photocoagulation，PRP)以及PPV的联合治疗较单一治疗手段有更大的优势[58-59]。关于联合治疗具体的治疗时间顺序[59]相关报道较少，还需要进一步研究调节和优化找出最佳治疗顺序。另外，皮质类固醇、提升紧密连接蛋白表达的潜在药物等联合PRP或PPV治疗对BRB损伤相关的眼部疾病是否效果更好也值得去探究。