在不同转移潜能人肺癌细胞移植瘤中血管性血友病因子的表达
2020-03-04司晓丽李双燕
司晓丽，李双燕，郭 超，张 松，张 立*
(1.甘肃中医药大学 基础医学院，甘肃 兰州 730000；2.兰州大学 基础医学院，甘肃 兰州 730000； 3.西北民族大学 生物医学生物研究中心，甘肃 兰州 730000)
血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)，是由巨核细胞/血小板和内皮细胞中合成的大分子血浆糖蛋白，多储存于内皮细胞W-P小体内或血小板颗粒中，内皮细胞受刺激时，可释放vWF，使血小板黏附于暴露的内皮下，在止血和凝血过程具有极重要的作用[1]。vWF还参与免疫应答、炎性反应和肿瘤转移[2-3]。高转移潜能人非小细胞肺癌D95细胞vWF表达显著高于低转移潜能人非小细胞肺癌C95细胞，前者黏附性较强[4]，提示vWF可能与肺癌的转移有关。本研究拟通过构建人高转移潜能肺癌细胞系D95和低转移潜能肺癌细胞系A549移植瘤裸小鼠模型，进一步揭示vWF与人肺癌细胞转移瘤的关系，为临床治疗肺癌转移提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞与实验动物:人低转移非小细胞肺癌细胞系A549和人高转移非小细胞肺癌细胞系D95(上海和元生物技术股份有限公司)；SPF级5周龄雄性Balb/c裸小鼠，10只，体质量(22±1)g(甘肃中医药大学实验中心，No.62001000000434),饲养于甘肃中医药大学实验中心SPF级动物饲所(No.00000539)。
1.1.2 试剂：RPMI-1640培养基粉末、0.5%胰蛋白酶-EDTA消化液(Gibco公司)；DMEM/F12培养基、青链霉素双抗(HyClone公司)；胎牛血清(Biological Industries公司)；基底胶Matrigel、2.5%结晶紫溶液、4%组织细胞固定液(Solarbio公司)；鼠抗vWF抗体(Immunoway公司)；山羊抗小鼠二抗和SP试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；小鼠vWF ELISA试剂盒(江苏菲亚生物科技有限公司)
1.2 方法
1.2.1 细胞的培养：将A549和D95两种肺癌细胞分别置于含10%胎牛血清的DMEM/F12和RPMI-1640培养基(含100 U/mL青、链霉素)中，37 ℃、5% CO2的细胞孵箱培养，2～3 d更换培养基。细胞增殖至80%左右0.5%胰蛋白酶消化并传代。
1.2.2 Transwell小室法检测体外侵袭：上室中加入40 μL预先稀释的基质胶，37 ℃孵箱30 min成胶。胰蛋白酶消化两组细胞，含1%胎牛血清的培养基调整细胞数为2×105个/mL，上室中接种100 μL细胞悬液，下室中加入500 μL含20%胎牛血清的培养基，37 ℃孵箱中培养24 h，弃去培养基，清洗并固定30 min，室温下风干，0.1%结晶紫染色30 min，棉签拭去上室内未侵袭肿瘤细胞及基质胶，倒置显微镜下随机取5个视野计数侵袭细胞数，各组重复3次。
1.2.3 Transwell小室法检测体外迁移：方法同1.2.2，上室中不加基质胶，各组重复3次。
1.2.4 裸小鼠移植瘤模型建立：肿瘤细胞经胰蛋白酶消化并制备成单细胞悬液，将细胞数调整至1×107个/mL，接种于裸小鼠左上肢腋窝皮下。接种后观察出瘤时间，触及瘤结节即为造模成功，每4 d测量小鼠体质量及移植瘤长径a和横径b，根据公式计算肿瘤体积(cm3)=(1/2)ab2,制作肿瘤生长曲线。
1.2.5 标本收集：出瘤3周后称量裸小鼠体质量，眼球采血制备血清，颈椎脱臼处死裸小鼠，剥离肿瘤组织测量长短径并称重，取肺和肝组织，计数肺和肝转移瘤结节数。
1.2.6 ELISA检测外周血vWF含量：按试剂盒说明书操作。
1.2.7 免疫组化检测移植瘤vWF蛋白表达：取已固定的两组移植瘤组织，常规石蜡包埋组织并连续切片，脱蜡水化，pH 6.0柠檬酸盐缓冲液抗原修复，加一抗，4 ℃冰箱过夜，次日取出37 ℃复温,加山羊抗鼠IgG二抗，室温下孵育、DAB显色、苏木精复染、封片和摄片，Image J图像分析软件测量vWF阳性表达区域的平均吸光度值。
1.2.8 免疫印记检测移植瘤、肺和肝vWF蛋白表达：取两组移植瘤、肺和肝组织剪碎加入蛋白裂解液提取蛋白，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，湿转，封闭，洗涤，加一抗，摇床振荡，4 ℃冰箱孵育过夜。加二抗，室温下孵育，洗涤，加ECL发光剂，暗室曝光，Image J图像分析软件分析条带吸光度值，以β-actin为内参计算vWF蛋白的相对蛋白表达量。
1.3 统计学分析
2 结果2.1 肿瘤细胞体外侵袭和迁移能力
与A549组相比，D95组肺癌细胞体外侵袭和迁移细胞数显著增多(P<0.05)(表1，图1)。
2.2 裸小鼠成瘤情况
D95组第3天可触及瘤结节，第5天均可触及，肺可见瘤结节，肝未见明显瘤结节；A549组第4天可触及瘤结节，第7天均可触及，肺可见少量瘤结节，肝未见明显瘤结节。与A549组相比，D95组移植瘤大小较为均一，质量显著增加(P<0.05)，肺转移瘤结节数量增多(P<0.05)(表2，图2)。
表1 两组肺癌细胞体外侵袭和迁移细胞数Table 1 Number of invasion and migration cells in vitro of lung cancer cells in both groups
*P<0.05 compared with A549 group.
2.3 外周血vWF的表达
D95组裸小鼠外周血vWF含量为(42.43±4.18)pg/mL显著高于A549组的(33.05±2.68)pg/mL(P<0.05)。
2.4 移植瘤vWF蛋白表达
vWF主要在移植瘤细胞胞质内表达，胞核也有部分表达,阳性染色呈黄色及棕黄色，D95组vWF阳性区域吸光度值为0.27±0.01显著高于A549组的0.18±0.02(P<0.01)(图3)。
A.invasion cells in A549 group; B.invasion cells in D95 group; C.migration cells in A549 group; D.migration cells in D95 group图1 不同转移潜能肺癌细胞体外侵袭和迁移Fig 1 Invasion and migration of lung cancer cells with different metastatic potential in vitro
表2 两组裸小鼠体质量、移植瘤体积、质量和肺转移瘤结节数比较Table 2 Comparison of mice mass,tumor volume,mass and lung metastatic cancer nodule number between two groups of nude
*P<0.05 compared with A549 group.
A, B.A549 group; C, D.D95 group; arrows indicated the positive area图3 移植瘤vWF蛋白表达Fig 3 vWF protein expression in transplanted tumor
2.5 移植瘤、肺和肝vWF蛋白相对表达量
与A549组相比，D95组移植瘤、肺和肝组织中vWF的表达显著增加(P<0.05)(表3，图4)。
表3 裸小鼠移植瘤、肺、肝vWF蛋白相对表达量Table 3 Expression of vWF in transplanted tumor, lung and liver of nude
*P<0.05，**P<0.01 compared with A549 group.
图4 裸小鼠移植瘤、肺、肝vWF蛋白表达Fig 4 vWF protein expression in transplanted tumor, lung and liver of nude mice
3 讨论
肿瘤转移是一个效率极低的过程，原发肿瘤细胞渗入循环系统后，须承受宿主血管或淋巴管内的物理剪切力及免疫细胞的攻击[5]，最终形成的转移灶非常少。这就需要肿瘤细胞在循环系统中与血小板结合形成异质体，vWF可作为中介分别与肿瘤细胞表面整合素αvβ3和血小板糖蛋白GPⅡb-Ⅲa连接形成肿瘤细胞-vWF-血小板复合体，协助肿瘤细胞逃避免疫监视，增加肿瘤细胞循环半衰期，该复合体可再次通过vWF黏附于血管内皮下的胶原，继而穿透血管壁，形成远处转移[4,6]。
vWF作为促进血小板聚集及内皮相互作用的主要参与者，其本身极有可能促进肿瘤细胞转移[3]。在骨肉瘤、胃癌及肝细胞癌等原位肿瘤组织中vWF呈高表达，且与转移率、临床病理分期及预后相关[7-9]。有报道在29例骨肉瘤标本中，13例肉瘤细胞及SAOS2肉瘤细胞中检测到vWF蛋白表达，且vWF在转移性骨肉瘤组织标本的表达高于原发灶[10]。在甲状腺未分化癌组织中vWF阳性表达率高于乳头状癌及正常甲状腺组织，且vWF表达与肿瘤直径和淋巴转移无相关，与肿瘤远处转移及临床分期相关[11]。尾静脉注射vWF过表达BGC823胃癌细胞的小鼠肺载瘤面积与总肺面积比值大于接受转染空质粒BGC823胃癌细胞的小鼠[12]。提示肿瘤细胞自身也能产生vWF,高表达vWF的肿瘤细胞可能具有较高的转移潜能。
目前，肺癌转移与vWF的研究报道较少。有报道随着肺癌级别的增加，癌组织vWF蛋白的表达水平也随之增加[13]，提示vWF与肺癌转移有关。本研究发现D95组移植瘤生长较快，vWF表达显著高于A549组，提示肿瘤细胞可产生vWF，与前述研究结果一致。D95组可见明显肺转移，肺表面癌结节数与肺组织vWF表达显著高于A549组。进一步验证vWF表达与肿瘤长短径无关,高表达vWF的肿瘤细胞具有较高的转移潜能。本结果还显示D95肿瘤细胞体外侵袭及迁移细胞数显著多于A549肺癌细胞，结合笔者前期对D95及C95肺癌细胞黏附的研究，表明vWF能够促进肿瘤细胞与细胞外基质黏附，提高其侵袭和迁移能力。
