右美托咪啶上调sirtuin3减轻小鼠肾缺血-再灌注损伤

武月玲，曲海霞，王俊星

(运城市中心医院/山西医科大学 第八临床医学院 麻醉科， 山西 运城 044000)

缺血-再灌注(ischaemia-reperfusion，I/R)可导致机体多种损伤。右美托咪啶(dexmedetomidine，DEX)可通过增高线粒体膜电位(△ψm)，减轻I/R导致的线粒体损伤[1-2]。去乙酰化酶3(sirtuin3，SIRT3)主要位于线粒体，是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖的去乙酰化酶[3]，其可通过脱乙酰化线粒体基质中的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase 2，SOD2)及亲环素D(cycolphilin D，Cyp D)发挥线粒体保护作用[4-5]。SIRT3过表达可通过恢复线粒体动力学缓解I/R引起的包括急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)在内的多种损伤[6-7]，表明在I/R中DEX与SIRT3具有重要关系。但DEX是否通过上调SIRT3缓解I/R引起的AKI尚不清楚。本研究观察肾I/R时DEX是否通过上调SIRT3发挥对肾的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：SPF级雄性C57 BL/6J小鼠50只，8周龄，23.5～26.5 g(山西医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK2019-0004)饲养于相对湿度45%～55%、昼夜循环12 h的SPF级动物房，适应性饲养1周后进行实验。

1.1.2 试剂：抗SIRT3及acetylated lysine抗体(Santa Cruz公司)；抗Cyt C抗体(Abcam公司)；抗Cyp D抗体(Cell Signaling Technology公司)；Protein G magnetic beads(Millipore公司)；Tunel试剂盒和HE试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司)；SIRT3活性检测试剂盒(上海钰博生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒-SIRT3 siRNA的构建：慢病毒携带的SIRT3 siRNA由上海吉玛公司设计、鉴定并扩增。方法步骤简述，小鼠SIRT3(Gene ID: 64384)siRNA序列(5′-GCGTTGTGAAACCCGACAT-3′)，并将其克隆至pCDH-CMV-MCS-EF1α-GFP-puro慢病毒载体中，经酶切及基因测序鉴定，将阳性表达载体共转染至HEK-293T细胞，收集上清液，并进行病毒滴度测定。

1.2.2 小鼠的分组及处理：将小鼠分为假手术(sham)组、siRNA+sham组、肾缺血-再灌注损伤(I/R)组、DEX+I/R组、siRNA+I/R组及siRNA+DEX+I/R组，每组至少6只小鼠。DEX+I/R组腹腔注射DEX(25 μg/kg)，siRNA+sham组、siRNA+I/R组、siRNA+DEX+I/R组术前3 d尾静脉注射5×109TU/mL/kg慢病毒-si-SIRT3。

1.2.3 肾功能的检测：用奥林巴斯AU2700自动生化分析仪测定小鼠血清肌酐及血浆尿素浓度。

1.2.4 HE染色法检测肾组织形态学：小鼠肾脏组织常规处理后，再HE染色，显微镜观察。

1.2.5 Tunel染色法检测肾组织凋亡：小鼠肾脏组织经常规处理后，再Tunel染色，显微镜观察。

1.2.6 SIRT3试剂盒检测肾组织SIRT3活性：取小鼠肾脏组织，按SIRT3试剂盒说明书检测肾组织SIRT3活性。

1.2.7 ELISA检测血清胱抑素C(cystatin C，Cys C)和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)的含量：取小鼠尾静脉血，分离血清，按ELISA试剂盒说明书检测血清中Cys C和NGAL的水平。

1.2.8 Western blot检测肾组织SIRT3、Cyp D、细胞色素C(cytochrome C，Cyt C) 及乙酰化Cyp D表达：通过RIPA裂解液取小鼠肾组织全蛋白，BCA法将各组蛋白样品定量至相同浓度。取15 μg蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后，湿转法将蛋白质转移至甲醇预活化的PVDF膜，转膜条件为恒压100 V 2 h后，5%脱脂牛奶室温下封闭1 h并以1∶2 000的稀释比例孵育Ⅰ抗体(SIRT3、Cyp D及Cyt C)，4 ℃过夜。次日，以TBST洗涤后室温孵育相应的HRP标记的Ⅱ抗(1∶10 000稀释)1 h，以TBST洗涤后利用化学发光成像仪显影。乙酰化的Cyp D检测采用乙酰赖氨酸残基抗体包裹蛋白磁珠G 沉淀，95 ℃变性，SDS分离蛋白转移至膜上，抗体孵育及显影方法同前。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 右美托咪啶可缓解小鼠肾I/R损伤

与sham组比较，I/R组血清肌酐、NGAL、Cys C及血浆尿素水平均明显升高(P<0.05)；与I/R组比较，DEX+I/R组上述指标均明显降低(P<0.05)(图1A～D)。I/R组肾小管扩张，腔内充血，上皮细胞呈空泡化且呈管状坏死；右美托咪啶处理可缓解I/R导致的病理变化(图1E，F)。

2.2 右美托咪啶可减轻I/R导致的肾损伤相关蛋白异常

与sham组比较，I/R组肾SIRT3水平明显降低，Cyt C及乙酰化Cyp D水平明显增高(P<0.05)；与I/R组比较，DEX+I/R组肾SIRT3水平明显增高(P<0.05)，Cyt C及乙酰化Cyp D水平明显降低(P<0.05)(图2)。

2.3 抑制SIRT3可减轻右美托咪啶缓解I/R肾损伤的作用

与DEX+I/R组比较，siRNA+DEX+I/R组血清肌酐、NGAL、Cys C及血浆尿素水平明显升高(P<0.05) (图3A～D)。与sham组比较，I/R组肾组织凋亡细胞数目明显增高(P<0.05)；DEX处理后，DEX+I/R组凋亡细胞数目较I/R组减少(P<0.05)，但在siRNA+DEX+I/R组，凋亡细胞数目明显高于DEX+I/R组(P<0.05)(图3E,F)。

2.4 抑制SIRT3减轻右美托咪啶对缓解肾损伤相关蛋白的作用

与sham组比较，I/R组肾SIRT3的活性明显降低(P<0.05)；DEX处理后，DEX+I/R组SIRT3的活性较I/R组明显增高(P<0.05)，但在siRNA+DEX+I/R组，SIRT3的活性明显低于DEX+I/R组(P<0.05) (图4B)，SIRT3的蛋白水平也有相似的结果(图4A,C)。与DEX+I/R组比较，siRNA+DEX+I/R组肾Cyt C (图4A,E) 和乙酰化Cyp D (图 4A,D)水平明显增高(P<0.05)。

3 讨论

外界刺激引起线粒体损伤是AKI的病理基础，阻止线粒体损伤的发生可有效缓解AKI[8]。有报道[6-7, 9]，SIRT3可通过抑制线粒体损伤来缓解I/R导致的心肌损伤及肾损伤。因此，本研究在肾I/R损伤模型中探讨DEX与SIRT3的关系。

A.quantification of serum creatinine level; B.quantification of serum NGAL level; C.quantification of serum Cys C level; D.quantification of plasma urea level; E.representative HE staining images of renal tissues in sham, I/R and I/R+ DEX treatment groups (scale bar=100 μm); F.semi-quantification of tubular necrosis in each group; *P<0.05 compared with sham group;#P<0.05 compared with I/R group图1 右美托咪啶可缓解I/R导致的肾功能损伤及病理改变Fig 1 Dexmedetomidine alleviated renal impairment and pathological changes caused by n=6)

A.representative Western blot images of SIRT3, Cyp D and Cyt C in renal tissues of each group; B.quantification of expression of SIRT3 protein; C.quantification of expression of acetylated Cyp D protein; D.quantification of expression of Cyt C protein; *P<0.05 compared with sham group; #P<0.05 compared with I/R group图2 右美托咪啶可减轻I/R导致的肾损伤相关蛋白异常Fig 2 Dexmedetomidine alleviated kidney injury associated protein abnormalities caused by I/R n=6)

A.quantification of serum creatinine level; B.quantification of serum NGAL level; C.quantification of serum Cys C level; D.quantification of plasma urea level; E representative Tunel staining images of renal tissues in each groups (scale bar=100 μm); F.semi-quantification of Tunel staining in each group; *P<0.05 compared with sham group; #P<0.05 compared with I/R group; △P<0.05 compared with DEX+I/R group图3 抑制SIRT3可减轻右美托咪啶缓解肾I/R损伤的作用Fig 3 Inhibition of SIRT3 attenuated the improving effect of dexmedetomidine on renal I/R injury n≥6)

A.representative Western blot images of SIRT3, Cyp D, Cyt C and acetylated Cyp D protein expression in renal tissues of each group; B.quantification of SIRT3 activity in renal tissues of each group; C.quantification of SIRT3 protein; D.quantification of acetylated Cyp D protein; E.quantification of Cyt C proteins; *P<0.05 compared with sham group; #P<0.05 compared with I/R group; △P<0.05 compared with DEX+I/R WT group图4 抑制SIRT3可减轻右美托咪啶对缓解肾损伤相关蛋白的作用Fig 4 Inhibition of SIRT3 attenuated the mitigative effect of dexmedetomidine on kidney injury-related

线粒体基质蛋白Cyp D过度乙酰化，导致线粒体功能障碍，引起Cyt C释放和caspase激活，最终导致肾损伤[10]。本研究发现：I/R可引起肾Cyp D过度乙酰化、Cyt C表达增高和细胞凋亡增加；DEX可改善上述变化，从而缓解肾组织病理学改变。Cyp D抑制剂环孢霉素A可缓解由Cyp D过度乙酰化导致的线粒体损伤[11]，与本研究结果一致。SIRT3作为脱乙酰酶，可通过对Cyp D脱乙酰化，阻止Cyp D与腺嘌呤核苷酸转运子的结合，抑制线粒体膜通道的开放，从而改善心肌I/R损伤[11]。本研究发现：在肾I/R损伤模型中，SIRT3活性及蛋白表达水平降低；DEX可上调SIRT3活性及蛋白表达，改善肾功能；而抑制SIRT3可逆转DEX对Cyp D过度乙酰化、Cyt C表达增高和细胞凋亡的缓解作用。DEX通过上调SIRT3的活性及蛋白水平来拮抗肾I/R损伤。

综上所述，DEX通过上调SIRT3在小鼠肾I/R损伤中起到保护作用。