单硝酸异山梨酯对慢性心力衰竭小鼠心功能的影响及作用机理

刘锦旋，吕涛，霍昱吉

慢性心力衰竭（CHF）是由冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）、心肌炎、心肌病以及心肌梗死等多种因素引起的一种临床常见的终末期心脏疾病，主要表现为心肌结构和功能损伤，心室射血和充盈功能下降[1]。CHF的发病机制复杂，研究显示，由炎性反应、氧化应激、心血管内皮功能损伤等多种原因导致的心室重构在CHF的发生发展中起着关键作用[2]。单硝酸异山梨酯（ISMN）是近年来逐渐应用于临床中的一种长效硝酸酯药物，药效学显示其具备扩张外周血管、松弛血管平滑肌、降低心肌耗氧以及减轻心室前后负荷等作用，已被广泛应用于冠心病、心绞痛、心肌梗死等心血管疾病的临床治疗中[3，4]。本研究旨在探讨ISMN对CHF小鼠心功能的影响及其可能的作用机理。

1 材料与方法

1.1 实验动物7周龄SPF级C57BL/6J品系雄性小鼠100只，体重20~22 g，购自广东省医学实验动物中心（许可证号：SCXK（粤）2017-0002），于室温24~26℃，湿度55%~65%的动物房内适应性喂养一周，期间自由活动与饮食。

1.2 造模与给药取20只小鼠作为假手术组。除假手术组外，其他小鼠参考缩窄腹主动脉的方法制备CHF小鼠模型[5]：腹腔注射3%戊巴比妥钠（30 mg/kg）将小鼠麻醉后，于剑突下腹部正中2~3 cm处打开腹腔，钝性剥离肌肉，游离腹主动脉，平行于腹主动脉放置7号手术针，用0号丝线将主动脉和针头结扎后，抽离手术针，确认腹主动脉通畅，关腹。假手术组小鼠仅分离腹主动脉但不结扎。小鼠术后3 d每天腹腔注射5万U青霉素以防感染。术中小鼠死亡2只。其余建模成功小鼠采用数字表法随机分为模型组、ISMN低剂量组、中剂量组和高剂量组。6周后ISMN各剂量组小鼠每天分别给予50 mg、200 mg、400 mg的 ISMN溶液（鲁南贝特制药有限公司，国药准字H10940039）灌胃，假手术组、模型组小鼠给予等体积的生理盐水灌胃。各组小鼠连续给药4周。

1.3 心功能指标检测各组小鼠末次给药2 h后，腹腔注射3%戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉，取仰卧位固定于手术台，采用多普勒超声心电图检测各组小鼠左室收缩末期内径（LVESD）、左室舒张末期内径（LVEDD）、左室射血分数（LVEF）、左室短轴缩短率（LVFS），每组原始数据连续测定3个心动周期，取平均值作为最终检测结果。

1.4 心肌病理学检查取小鼠左心室心肌组织50 mg，于10%多聚甲醛溶液中固定12 h，常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制成4 μm的组织切片。常规脱蜡至水，梯度乙醇脱水，苏木精（碧云天生物技术有限公司）染色 3 min，自来水冲洗。1%盐酸乙醇溶液分化 10 s，0.2%氨水返蓝30 s，自来水冲洗。伊红（碧云天生物技术有限公司）复染3 min。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光学显微镜下观察小鼠心肌组织病理变化。

1.5 血液流变学指标检测各组小鼠处死前眼眶取血0.5 ml，肝素抗凝，室温静置2 h，采用BT-300A全自动血液流变测试仪（南京志伦科技有限公司）测定各组小鼠全血高切粘度（mPa·s）、全血低切粘度（mPa·s）、血浆粘度（mPa·S）和红细胞聚集指数水平。

1.6 氧化应激指标检测各组小鼠处死前眼眶取血0.5 ml，肝素抗凝，室温静置2 h，4000 g离心15 min，收集上层血清。采用一氧化氮合酶（NOS）ELISA检测试剂盒（上海钰博生物科技有限公司）、超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）、丙二醛（MDA）ELISA检测试剂盒（上海钰博生物科技有限公司）、谷胱甘肽过氧化酶（GSH-Px）试剂盒（南京建成生物工程研究所）检测小鼠血清NOS、SOD、MDA和GSH-Px水平，具体操作严格按照相关试剂盒说明书进行。

1.7 统计学方法所有数据均采用SPSS 23.0统计学软件分析。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，两组间均数的比较采用t检验；计数资料采用例数（构成比）表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠心功能指标比较模型组小鼠LVESD和LVEDD水平较假手术组显著升高，LVEF和LVFS水平显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；ISMN治疗后， ISMN低剂量组、中剂量组、高剂量组小鼠LVESD和LVEDD较模型组小鼠呈剂量依赖性下降，LVEF和LVFS呈剂量依赖性上调，差异有统计学意义（P＜0.05），提示ISMN可显著改善CHF小鼠的心功能损伤（表1）。

2.2 各组小鼠心肌病理比较病理结果显示，假手术组小鼠心肌细胞结构完整，肌纤维排列整齐，无炎性细胞浸润发生；模型组小鼠心肌细胞不同程度变性和肥大，且呈局灶性坏死，肌纤维间隙增加，并伴有大量炎性细胞浸润；与模型组比较，ISMN低剂量组、中剂量组和高剂量组小鼠心肌细胞变性、肥大和坏死程度依次降低，肌纤维排列趋向规整，炎性浸润程度明显降低，且具有显著的剂量依赖性，差异有统计学意义（P＜0.05）（图1）。

2.3 各组小鼠血液流变学水平比较统计结果显示，模型组小鼠全血高切粘度、全血低切粘度、血浆粘度和红细胞聚集指数较假手术组显著升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与模型组小鼠比较，ISMN低剂量组、中剂量组和高剂量组小鼠全血高切粘度、全血低切粘度、血浆粘度和红细胞聚集指数均呈剂量依赖性下降，差异均有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

2.4 各组小鼠氧化应激水平比较与假手术组比较，模型组小鼠MDA的血清含量显著增加，SOD、GSH-Px和NOS的含量显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，ISMN低剂量组、中剂量组和高剂量组小鼠MDA的血清含量逐渐下降，SOD、GSH-Px和NOS的含量则依次升高，且呈显著的剂量依赖效应，差异有统计学意义（P＜0.05）（表3）。

图1 各组小鼠心肌组织HE染色结果（200×）

3 讨论

表1 各组大鼠心功能指标比较（±s）

表1 各组大鼠心功能指标比较（±s）

注：LVESD：左室收缩末期内径；LVEDD：左室舒张末期内径；LVEF：左室射血分数；LVFS：左室短轴缩短率；与假手术组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与低剂量组比较，cP＜0.05；与中剂量组比较，dP＜0.05

指标 假手术组 模型组 低剂量组 中剂量组 高剂量组LVESD（mm） 2.93±0.27 6.88±0.55a 5.79±0.50ab 5.30±0.48abc 4.42±0.39abcd LVEDD（mm） 5.01±0.40 10.03±0.78a 8.98±0.66ab 7.84±0.69ab 6.77±0.48abcd LVEFS（%） 82.16±6.58 33.46±2.89a 45.15±4.00ab 54.61±4.77abc 67.01±5.22abcd LVFS（%） 60.05±4.97 22. 28±2.17a 26.47±2.42a 35.14±2.88abc 42.80±3.77abcd

表2 各组小鼠血液流变学水平比较（±s）

表2 各组小鼠血液流变学水平比较（±s）

注：与假手术组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与低剂量组比较，cP＜0.05；与中剂量组比较，dP＜0.05

指标 假手术组 模型组 低剂量组 中剂量组 高剂量组全血高切粘度（mPa·s） 3.27±0.25 6.11±0.40a 5.44±0.37ab 4.70±0.33abc 4.05±0.31abcd全血低切粘度（mPa·s） 6.03±0.41 11.48±0.77a 10.54±0.75ab 9.37±0.70abc 8.15±0.62abcd血浆粘度（mPa·s） 1.58±0.14 2.20±0.19a 2.10±0.17 1.92±0.18abc 1.70±0.14abcd红细胞聚集指数 5.79±0.38 8.04±0.62a 7.41±0.56ab 6.78±0.49abc 6.43±0.44abc

表3 各组小鼠血清氧化应激水平比较（±s）

表3 各组小鼠血清氧化应激水平比较（±s）

注：MDA：丙二醛；SOD：超氧化物歧化酶；GSH-Px：谷胱甘肽过氧化酶；NOS：一氧化氮合酶；与假手术组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与低剂量组比较，cP＜0.05；与中剂量组比较，dP＜0.05

指标 假手术组 模型组 低剂量组 中剂量组 高剂量组MDA（nmol/mg pro） 1.37±0.22 7.85±0.69a 6.36±0.52ab 5.02±0.50abc 3.87±0.30abcd SOD（U/mg pro） 269.55±22.31 111.29±15.47a 145.70±15.93ab 178.02±16.06abc 209.54±18.26abcd GSH-Px（U/mg pro） 80.03±6.76 29.49±2.70a 41.17±3.32ab 50.50±3.84abc 59.28±4.61abcd NOS（U/mg pro） 3.83±0.25 0.18±0.01a 1.71±0.15ab 2.30±0.17abc 3.14±0.22abcd

ISMN又称5-单硝酸异山梨酯，是常见的硝酸酯类抗心绞痛药物，因其半衰期较长，不受肝脏代谢的影响，能通过舒张血管平滑肌、扩张静脉血管和冠状动脉减少心脏负荷，被广泛应用于心绞痛或心肌梗死的临床治疗当中[6，7]。其作用机制主要包括以下方面：扩张周围静脉，减少回心血量，降低心脏负荷；扩张动脉血管，降低外周血管阻力和心脏后负荷；扩张冠状动脉，改善血流分布和心肌供血；抑制血小板功能，避免血管内粥样斑块的形成和血管狭窄的发生。以上功效综合作用促使心肌耗氧量降低，供氧量增加，心肌收缩力增强，缺血组织灌注量也得到显著的改善[8，9]。

心室重塑是CHF发生发展的基本机制，包括心肌细胞凋亡、坏死、肥厚和心肌纤维化等[10]。由心室重塑导致的心肌收缩和舒张功能障碍、心排出量不足、肺循环或体循环系统淤血是CHF的具体临床特征。因此心肌代谢及收缩舒张功能的改善、心脏负荷和耗氧量的降低、静脉和动脉双重血管的扩张对CHF心功能损伤的调节具有关键作用。小鼠心功能指标检测结果显示，与假手术组比较，模型组小鼠的LVESD和LVEDD显著升高，LVEF和LVFS显著降低，心肌细胞肥大且存在坏死，肌纤维断裂、紊乱，并伴有大量炎性细胞浸润，提示CHF模型建立后小鼠的心功能严重受损；经ISMN治疗后，与模型组比较，各剂量组小鼠LVESD和LVEDD呈剂量依赖性下降，LVEF和LVFS呈剂量依赖性上升；此外，各剂量组小鼠的心肌细胞肥大、坏死和炎性浸润程度依次降低，肌纤维排列趋向规整，表明经ISMN治疗后，CHF小鼠的心功能损伤得到显著的改善。

为了进一步明确ISMN通过何种作用途径调节CHF小鼠的心功能异常，我们对各组小鼠的血液流变学相关指标进行了检测。结果显示，与假手术组比较，模型组小鼠全血高切粘度、低切粘度、血浆粘度和红细胞聚集指数显著上升，提示血液流变学的异常变化密切参与CHF的发生发展；而ISMN治疗后，小鼠的上述指标较模型组均呈剂量依赖性下降，ISMN降低以上指标的原理可能为：有研究显示，长期的低氧环境引起红细胞增生过度，血液粘稠程度增加，机体微循环的淤血状态又可反向导致血流阻力上升，加重心肌细胞的缺氧和损伤[11]。ISMN可能通过扩张心脏冠状动脉降低血管内血小板的粘附和聚集，促进纤维素的溶解，减轻肺循环和体循环阻力，从而缓解CHF小鼠的心肌缺血和缺氧等异常病理状态，最终改善小鼠的心肌受损。

以往的研究显示心肌缺血引起的机体氧化与抗氧化的失衡可加剧心功能的损伤及炎性反应的程度[12]。机体氧自由基的增加和自由基清除酶的活性下降是导致氧化应激损伤的直接诱因[13]。我们通过对小鼠氧化应激水平的检测探究ISMN在此过程中扮演着何种角色。MDA是过氧化脂质氧化分解的终末代谢产物，可反映机体氧化损伤的程度；SOD作为体内清除氧自由基的关键酶，可直接反映机体氧自由基的水平；GSH-Px是细胞中一种重要的过氧化物分解酶，可有效抑制过氧化反应引起的细胞损伤；NOS的活性直接反映机体NO的水平。本研究结果显示，CHF模型小鼠建立后，MDA活性增加，SOD和GSH-Px活性下降，提示CHF模型的建立将小鼠体内的氧化应激状态较为活跃；而经ISMN治疗后，各剂量组小鼠的MDA活性逐渐下降，SOD和GSH-Px活性依次升高，表明CHF小鼠体内氧化应激受到显著抑制。此外，NO密切参与血管扩张、促进内皮细胞增殖、抑制炎性细胞粘附和氧化应激、增强血管通透性等一系列生理病理过程[14]，可能是改善心功能损伤的关键因子。本研究结果显示，作为NO合成的关键酶，NOS在模型组小鼠中的活性较假手术组显著降低；ISMN治疗后，各剂量组小鼠的NOS活性则逐渐回升。已有研究证明ISMN在血管平滑肌可与细胞内巯基结合，产生的NO和S-亚硝基巯基化合物通过激活鸟苷酸环化酶提高鸟苷酸的含量，降低细胞内钙离子浓度，从而舒张血管平滑肌。本研究则在此基础上进一步证明 ISMN可通过提高机体内NOS的活性，产生大量的NO，从而激活下游多条信号途径，最终达到改善小鼠心功能损伤的目的。

综上所述，ISMN可能通过提高NO水平调节机体微循环的淤血状态，抑制细胞内氧化应激和炎性反应水平，从而改善CHF小鼠的心功能损伤。