新型冠状病毒感染的临床表现及其实验室检测技术进展*

魏徵霄 综述,李青峰 审校

(四川省成都市公共卫生临床医疗中心,四川成都 610066)

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)属于冠状病毒属，是一种阳性单链RNA病毒,主要通过呼吸道传播的RNA病毒,具有极高传染性,被世界卫生组织(WHO)列为对人类危害最严重的病毒之一。但鉴于目前尚无特异性的靶向杀灭SARS-CoV-2的药物，而认识SARS-CoV-2结构、感染机制和实验室检查可能有助于开发有效的治疗方法，故本文就SARS-CoV-2特征、感染的临床表现及其实验室检测技术研究进展予以综述，以期为更好地防控、诊断和治疗COVID-19提供参考。

1 病毒学特征与流行病学特点

冠状病毒是球形或椭圆形的,有包膜,基因组为线性单股正链的RNA,在自然界中广泛存在的一类病毒。它们的宿主范围很广,包括鸟类、农场动物、宠物、骆驼和蝙蝠,主要引起呼吸道和胃肠道疾病。直到1975年,世界病毒命名委员会对其进行正式命名,其目、科属的关系才真正弄清楚:它们属于巢病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)和正冠状病毒亚科(Orthocoronaviridae)。冠状病毒有四个属,分别是Alphacoronavirus、Betacoronavirus、Deltacorona和Gammacoronavirus[1-3]。SARS-CoV-2属于Betacoronavirus。

在2019年12月之前,科学界共发现有6种致病性的冠状病毒,它们是属于Alphacoronavirus属的HCoV-229E和HCoV-NL63,以及属于Beta冠状病毒属的HCoV-OC43、HCoV-HKU1、MERS-CoV和SARS-CoV[1-2]。其中有4种冠状病毒(HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43和HCoV-HKU1)较常见,容易引起儿童和成人发生类似普通感冒的轻微呼吸道症状,致病性较低,医学重视性不高。另外急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征的冠状病毒(MERS-CoV)可以产生严重的下呼吸道感染,这两种冠状病毒都能导致人畜共患病,SARS和MERS的冠状病毒曾大规模暴发,在感染者中造成极高病死率(分别为10%、37%),构成了重大的公共卫生威胁和重大生命财产损失[1,4]。

ZHU等[5]研究报道通过对肺炎患者样本进行测序,发现了一种新的β冠状病毒属(β-coronavirus)病毒,命名为2019年新型冠状病毒肺炎(COVID-19),该病毒与中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)和严重急性呼吸综合征病毒(SARS-CoV)不同,成为可以感染人类的冠状病毒科的第7个成员。

中国疾控中心(CDC)团队在患者下呼吸道取得样本,通过测序获得病毒的完整基因序列。将基因组序列、引物、标准操作程序与WHO共享,有助于开发灵敏的RT-PCR检测技术,实现快速检测。病毒株的获取也有利于推动血清学检测技术,以期开发更灵敏的检测标志物。

2 SARS-CoV-2感染:COVID-19及其临床表现

2.1 传播方式 研究者通过测序发现SARS-CoV-2与蝙蝠冠状病毒最密切相关,甚至在nsp7和E蛋白中与Bat-SL-CoVZC45表现出100%的氨基酸相似性,整体基因组序列一致性为96.2%,通过对蝙蝠中多种SARS样冠状病毒的鉴定,推断蝙蝠可能是这些病毒的天然宿主[6-7]。但是,由于首次报告该病时市场上有多种其他动物在售,因此需要更多的调查来确定SARS-CoV-2的天然宿主和中间宿主。

SARS-CoV-2过呼吸道进入人体[8],感染导致COVID-19,其主要传播方式以呼吸道飞沫为主,普通人群易感,平均潜伏期为5.2 d,基本繁殖数(R0)为2.2。大多数COVID-19患者为临床轻度病例。也有研究者指出患有基础疾病(包括高血压、糖尿病、心脏病和/或肾病等)的老年男性死亡风险更高[7]。

有研究者从COVID-19感染者的粪便样本中分离出SARS-CoV-2,证实了粪便中的确存在活病毒[9],但是,SARS-CoV-2的感染是否存在粪口传播途径还有待于科学界进一步证实。

目前也有新生儿出生30 h后发生COVID-19的病例,母婴传播是否真实存在,尚待进一步明确。而且有研究指出，减少人群聚集,并对潜在感染人群采取隔离等措施能有效预防或减少传播的可能[10-11]。

2.2 感染机制 有研究表明SARS-CoV-2主要通过Spike蛋白(S蛋白)与宿主细胞血管紧张素转化酶2(ACE2)受体结合来介导病毒的入侵,冠状病毒S蛋白S1亚单位的N端结构域(S1-NTD)和C端结构域(S1-CTD)都能作为受体结合域(RBD)[12-13]。一般认为S1-NTD结合糖类受体,S1-CTD结合蛋白类受体。

病毒通过S蛋白中的Arg426与ACE2中的Gln325/Glu329之间的氢键相互作用,来感染人的呼吸道上皮细胞,进入细胞后,病毒RNA释放出来,并整合到宿主的遗传物质中,不断地繁衍复制,并通过胞吐作用将病毒颗粒从被感染的细胞中释放出来；同时SARS-CoV-2和细胞表面的ACE2一同过入胞内,导致细胞表面ACE2蛋白减少,ACE2蛋白的主要生理功能是扩展血管,调节血压,与高血压、糖尿病、冠心病等代谢病密切相关,这也从侧面解释了具有基础疾病的人群COVID-19的易感性。COVID-19的感染机制还有很多未知,某些假设或推断亟待科学界继续深入研究以获取更多更可靠的证据。

2.3 临床表现 COVID-19以发热、干咳、乏力为主要特征,伴或不伴有发热,部分伴有鼻塞、流涕、咽痛等类似感冒症状。根据国家卫生健康委员会办公厅、国家中医药管理局办公室印发的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第6版)》，重症患者可发展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒血症休克、代谢性酸中毒、凝血功能障碍及多器官衰竭等,并出现明显的肺部影像学变化。

在一项针对41名住院患者的研究中,大多数患者均报告有发烧、干咳、肌肉酸痛和疲劳症状,很少出现咳嗽、头痛、咯血和腹泻的症状[14]。根据该研究,这些患者中约有一半患有合并症,例如潜在的糖尿病,高血压和心血管疾病。此外,患者入院后平均约8 d出现呼吸困难并伴有异常胸廓CT和肺炎,与病毒性肺炎相似,患者的X射线或胸部CT图像显示单侧或双侧肺部受累。临床并发症包括急性呼吸窘迫综合征、急性心脏损伤、继发感染和气胸等,这也与CHEN等[15]关于99例病例的回顾性分析的临床表现大致相同。

COVID-19感染者血细胞计数显示白细胞减少和淋巴细胞减少,部分患者出现部分生化指标的异常,ICU患者的凝血酶原、D-二聚体和细胞因子处于较高水平[14]。因为COVID-19轻症的临床表现与流行性感冒相似缺乏特异性,所以无法仅从患者的临床表现诊断SARS-CoV-2感染,在《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第6版)》将实时荧光RT-PCR核酸检测阳性或病毒基因测序作为金标准。

3 SARS-CoV-2感染的实验室检测

COVID-19的临床诊断必须依据患者相关的流行病学史(两周内的活动或旅行地区为武汉或14 d内有SARS-CoV-2感染者的接触史)、临床症状、实验室检测结果等予以综合性判断,目前确诊以实验室检查为准,改变的是判读的方式。对SARS-CoV-2感染的实验室诊断主要有病原学和血清学等检测技术。检测的样本可以是疑似患者的鼻咽拭子、痰和其他下呼吸道分泌物、血液、粪便等。

3.1 病原学诊断

3.1.1 基因测序 病毒的全基因组测序是研究病毒进化、毒力因子变异的基础。在COVID-19暴发的初期,有研究通过二代测序获得了该病毒的整个基因组序列,并对7个保守的非结构蛋白序列比对分析,发现SARS-CoV-2与SARS-CoV同源性(79.5%)[16]。同样的有研究者也发现了SARS-CoV-2与NC_004718、bat-SL-CoVZC45和蝙蝠中检测到的冠状病毒(bat/Yunnan/RaTG13/2013)具有极高的基因组序列相似度(80%、88%、96%)[17]。基于数据共享理念,国家生物信息中心(CNCB)/国家基因组科学数据中心(NGDC)建立了2019新型冠状病毒信息库(2019nCoVR https://bigd.big.ac.cn/ncov),为检测试剂盒研发、抗病毒药物靶点设计等相关研究提供了支持。

3.1.2 核酸检测 病毒核酸可用于早期检测。根据《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南(第2版)》，现已建立的SARS-CoV-2特异性核酸检测技术其病毒目标片段是病毒ORF1ab和N基因,采用一步法、磁珠法或柱提法反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)或实时荧光RT-PCR技术[13]。

与普通PCR相比,实时荧光 RT-PCR利用信号实时监测PCR反应过程中每一个循环扩增产物量的变化,可以对初始模板量进行定量检测分析。具有灵敏、特异、准确、快捷且重复性好等诸多优势,深受临床检验工作者青睐。CORMAN等[18]在没有病毒基因组核酸物理来源的情况下,建立了一种基于实时荧光RT-PCR技术,基于网络公布的2019新型冠状病毒数据库,设计的特异性引物检测RdRP基因、E、N基因,以此检测SARS-CoV-2,并进一步将SARS-CoV-2与SARS-CoV区别开来。ZHOU等[13]开发了一种基于刺突基因受体结合域的实时荧光定量PCR检测方法,应用于当时7例病毒感染者血液、咽拭子及肛拭子样本的检测,能够将SARS-CoV-2与包括人类在内的所有其他冠状病毒分开。CHU等[19]报道了两种用于检测SARS-CoV-2的单步实时反转录聚合酶链反应检测方法的开发。两种测定法靶向病毒基因组的Orf1b和N区,发现N检测比靶向Orf1b的检测更为灵敏。笔者建议将前者用作筛选测定,而将后者用作诊断测定。

3.1.3 病毒的分离与培养 病毒的分离与培养是病毒感染实验诊断的经典技术,也是病原学鉴定的“金标准”。对于SARS-CoV-2,病毒研究机构可以通过经典的科赫氏法则对该病毒进行初步鉴定,并通过电子显微镜观察其形态[20]。

ZHOU等[13]以哺乳动物细胞系Vero、Vero E6和Huh7为感染材料进行了SARS-CoV-2的分离与培养,并通过RT-PCR证实了病毒的存在。但是病原体的分离与培养需要时间长、实验室技术条件要求高,不宜于快速诊断,但分离的纯培养毒株对于病原体的生物学特征、感染机制、治疗药物及疫苗的研究等都是不可或缺的。

3.2 免疫血清学检测 由于分子诊断和病毒培养受限制条件较多,开发血清学检测试剂引起了科学界极大的兴趣。已报道对MERS-CoV检测的血清学方法包括中和试验(NT)、酶联免疫吸附测定试验(ELISA)、间接免疫荧光(IFA)、蛋白质微阵列(PM)、免疫印迹(Western-blot)等[21]。整体来说,血清学检测相比核酸检测,易于快速操作,但灵敏度和特异度较低[22-23]。

ELISA基于抗原与抗体特异结合特点,利用酶的催化与信号放大作用,来判断样本的阴阳性,是目前血清学检测通用的方法之一[24]。在ELISA早期方法建立中,主要以灭活病毒株为抗原制备单克隆抗体[25]。大多数冠状病毒具有相似的病毒结构,相似的感染途径和相似的S蛋白结构[26],这表明相似的研究也可能适用于SARS-CoV-2。QIU等[27]用含有S蛋白的可溶性重组RBD免疫野生型小鼠,然后将小鼠进行人源化分离,或直接免疫转基因小鼠以获得人源化的抗体,用于治疗MERS-CoV感染。

有研究使用编码冠状病毒刺突蛋白的基因,证实了假病毒中和抗体测试(ppNT),具有很高的灵敏度和特异度[28-29]。这也为将来开发鉴定SARS-CoV-2的相关抗原和单克隆抗体提供了借鉴。JIANG等[30]证明了SARS-CoV S蛋白中的RBD是SARS患者中和抗体的主要靶标,并且能够在动物模型中诱导高效的中和抗体应答和长期保护性免疫,它包含6个不同的构象的中和表位,能产生了一系列具有不同中和活性的小鼠单克隆抗体(mAb),该小组还表明,这些SARS-CoV-RBD特异性中和单克隆抗体可以交叉中和蝙蝠SL-CoV,例如蝙蝠SL-CoV-W1V1[31],从一定程度上表明这些抗体也可以交叉中和SARS-CoV-2。

有研究者针对98例SARS患者的研究发现一般在感染7 d后可以发现IgM阳性,并在发病3周后阳性最高,15 d左右出现IgG阳性,60 d左右阳性最高,且持续时间较长[32]。ZHANG等[33]使用SARSr-CoV Rp3 NP作为抗原开发的用于检测SARS-CoV-2的IgG和IgM ELISA试剂盒,连续监测15例COVID-19患者IgG和IgM的滴度变化,发现采样第5天IgG的阳性率(81%～100%)和IgM的阳性率(50%～81%)都大幅增加,这与核酸相对较低的阳性检出率(50%)相反。蛋白印迹比ELISA更加特异,但由于过程繁琐,更适用于验证抗体的存在,不适用于大批量样本筛查[21]。

4 总结及展望

SARS-CoV-2与SARS-CoV和MERS-CoV同源,它们都属于Beta冠状病毒。由于SARS-CoV-2在全球范围内传播,这对临床管理构成重大挑战,对公共健康构成了巨大威胁。目前尚没有疫苗或针对性药物治疗SARS-CoV-2感染,所以实验室检测手段的加强能够缩短检出时间,在一定程度上减少甚至遏制病毒的传播。

目前虽然已经有许多实验室检测方法可以用于SARS-CoV-2的检测。病毒分离培养耗时长,对样本保存要求较高,限制了在实际工作中的应用。核酸检测可以在P2级实验室中将病毒灭活后进行检测,在目前的实验室检测技术中应用较为广泛,抗原抗体检测方法由于操作简便易行,在时间工作中更易于推广。

在疫情暴发的当下,鉴于实验室检测结果在疾病诊断中的重要作用,呼吁多种检测方法联合使用,更快更准确地对疾病进行诊断。由于SARS-CoV-2的高度传染性,操作简单、设备简单、样本用量少、能快速现场进行检测的试剂开发是今后SARS-CoV-2检测的发展方向。