内源性细胞介导肝脏再生的研究进展

董冰子，陈述海，邹浩，冯玉杰，张炳远，朱呈瞻2，

（1.青岛大学附属医院 内分泌与代谢性疾病科，山东 青岛 266003；2.山东省数字医学与计算机辅助手术重点实验室，山东 青岛 266003；3.日本德岛大学 消化器移植外科，日本 德岛 770-8503；4.青岛大学附属医院 肝胆胰外科，山东 青岛 266003）

对于肝脏再生最早的描述可以追溯到古希腊神话中的普罗米修斯，他因将偷来的火焰传给了人类而被宙斯锁在岩石上，他的肝脏每天都被一只恶鹰啄食，然而惊奇的是肝脏会重新生长出来[1]。如果说那时的神话只是人们对于自然界和生命体混沌的臆测，那么在19世纪，肝再生这一神奇的过程最早被科学地描述[2]。肝再生涉及的机制复杂、内容繁多，虽然对其的研究已经持续了100多年，但是目前我们仍然不完全理解其机制。当前主要的关键点如下：（1）肝脏再生是涵盖众多不同的肝内和肝外细胞成分和大量信号分子在损伤或者特定微环境中的复杂且受到精密调节的相互作用，并且具有时序性。鉴于肝脏具有对生命体重要的代谢功能，饱和式的细胞分子信号通路构成的作用模块对启动、维持和终止进行严格的调节，以确保肝再生可以在严重损伤时仍能顺利进行以恢复肝脏质量[3-4]。（2）肝再生过程的神奇体现在人可以在没有或者近乎肝功能丧失的情况下再生或者在遭受巨大的损害时存活，这是由于肝再生的细胞来源广泛，应对不同程度的肝脏损伤具有多种再生方式。这些关键点既是挑战也恰恰就是研究的热点和突破点。我们一直期待通过加深对肝脏再生过程的理解来服务于临床，比如寻找加速人类肝再生的新手段，通过细胞治疗和组织工程等再生医学的策略开发肝衰竭的新疗法，逆转肝纤维化，扩展肝切除术特别是老年人肝切除术的适应范围和平衡肝脏移植特别是活体肝脏移植供体受体基本的生存需要等[5-6]。我们综述了这一主题最新的研究进展，并提出我们的思路。

1 肝脏再生的组织学基础

肝脏由100～150万个基本结构单位肝小叶组成，血液从门静脉和肝动脉的分支进入肝脏，经过肝血窦后进入肝小叶中心的小叶中央静脉最终汇入下腔静脉，形成了递减的含氧浓度梯度，并由此形成了从肝动脉，门静脉和肝内胆管的分支形成的门静脉三联体到中央静脉的特定的肝小叶排列顺序。不同区域的肝细胞亚群存在关键酶或蛋白质的差异性表达，获得了各自独特但互补的代谢和分泌功能：门静脉周围肝细胞涉及糖异生、β-氧化等高能量的过程，中央静脉周围的肝细胞进行糖酵解，胆汁酸的合成以及物质代谢。这种组织学排布使得不同区域的肝细胞的基因表达及暴露于各种因子的浓度不同，从而在再生水平上存在异质性[5]。肝细胞是有3个质膜结构域的极化细胞，基底外侧区域面向血窦并与Disse空间接触，横向与相邻的肝细胞紧密连接以形成肝细胞索，胆管结构域是分泌细胞极，表达特异性蛋白转运胆汁。两到三个相邻肝细胞的胆管结构边缘的并置形成直径约1 μm的细胞间隙并接收原发性胆汁，称为胆小管，胆小管汇合到肝祖细胞（hepatic progenitor cells，HPCs）存在的Hering管中[7]。位于肝索之间的肝窦内定植有肝窦内皮细胞和称为库普弗细胞的肝巨噬细胞，而散布着含有脂质和维生素A的肝星状细胞的Disse空间是血液和肝细胞之间双向分子交换的位点。肝小叶间的结缔组织隔膜非常薄，含有少量的细胞外基质。间皮细胞覆盖肝脏的最外侧，分泌润滑液，可以在肝再生过程中分泌多效生长因子促进肝细胞增殖[8]。

2 肝再生的经典机制

与肠道、皮肤等增生活跃一般的上皮不同，肝脏中成熟的肝细胞可以重新进入细胞周期进行有丝分裂从而完成自我更新维持肝脏维持稳态或应对损伤后的再生，而不需要祖细胞的参与[9-10]。Wang B等[11]研究发现位于中央静脉周围的Axin2+肝细胞具有干细胞特征，能够在临近的内皮细胞产生的Wnt信号介导下，完成自我复制和更新。Pu W等[12]的研究发现部分位于门静脉三联体区的Mfsd2a+肝细胞在肝内稳态期间数量很少，但可被部分肝切除术或慢性肝损伤期间诱导的肝再生明显激活而在整个肝脏内复制扩展，其代谢特征被区域微环境重新编辑后直至完全取代小叶中央区域的肝细胞群。Li D等[13-14]利用SOX9-GFP转基因标记的小鼠研究发现具有SOX9和HNF4α阳性表达的肝细胞和胆管上皮细胞混合表型的肝细胞位于门静脉和胆道末端分支附近，并称之为混合肝细胞（hybrid hepatocytes，HybHP）。这些肝细胞可以在肝脏发生损伤后大量增殖，产生新的肝细胞和胆管上皮细胞，重新填充受损的肝小叶，并且不会增加癌症的发病率。这些说明肝脏的不同损伤模式引发了肝脏的不同应答，不同组织排布区域的肝细胞可以相互替代，提示成熟肝细胞的新特征——高复制能力和可塑性。

在肝切除诱导的肝再生中，切除体积与再生模式密切相关。当切除90%肝体积时，术后早期再生资源的缺乏使肝细胞的增殖出现延迟。在此期间，有限的资源首先保证肝脏的代谢功能从而维持机体的稳态[6]。对于70%肝切除模型，最初的观点认为几乎所有残余的肝细胞都进入细胞周期进行了细胞分裂，这意味着所有肝细胞平均需要进行1.6次的分裂才能重新恢复原始的肝脏体积。然而实际上并非如此，人类成年肝脏由超过20%的多倍体细胞组成，而在啮齿动物中则高达70%[15]。肝部分切除术后多倍体肝细胞以肥大作为再生的响应，随后双核肝细胞进行细胞分裂以增加细胞数量。而当切除体积比例更少时，肝脏主要通过多倍体细胞的补偿性生长而再生，细胞分裂很少，其倍性没有改变。近年许多学者发现二倍体肝细胞更早进入细胞周期并且比多倍体更快地增殖，而肝细胞多倍性的增加和肝再生受损有关。这提示二倍体肝细胞是肝再生和肿瘤生长的最直接驱动因素，多倍体状态作为生长抑制剂限制大多数肝细胞增殖从而维持内稳态[16-17]。

在经典的肝细胞介导的再生过程中，肝脏产生包括肝细胞、胆管细胞、库普弗细胞、肝星状细胞和肝窦内皮细胞的动态多细胞反应。此外，血流应力信号、免疫因素、神经与激素、胆汁酸与肠道菌群和招募的肝外细胞和介质等肝外组分在被重塑的细胞外基质中，共同构成了肝再生的微环境。在各种促增殖因子和增殖抑制因子的调控下，肝脏启动再生并及时终止再生，实现肝再生调控点对维持机体稳态的重要意义[18]。肝部分切除术后单位组织的门静脉血流增加，血管内皮细胞受到的机械应力激活尿激酶引发基质金属蛋白酶（MMP）介导的细胞外基质降解，使细胞外基质中鳌合的肝细胞生长因子（HGF）被快速地释放和激活。同时，炎症反应促进补体C3a、C5a和脂多糖（LPS）的产生，LPS与TLR4受体结合介导肝脏巨噬细胞释放肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）。肝星状细胞和肝窦内皮细胞产生的新生HGF连同增加的门静脉血流中来自肠和胰腺的生长因子和细胞因子等共同维持了基质微环境中TNF-α、IL-6、HGF和表皮生长因子（EGF）等肝有丝分裂原的高浓度状态。HGF与其受体C-MET结合，TGF-α和EGF与其共同受体EGFR结合启动肝细胞内Wnt/β-catenin，STAT3和NF-κB等多条传导通路[19-20]。IL-6与膜上的IL-6R，可溶性IL-6R及gp130形成激动复合物导致肝细胞内JAK/STAT、MAPK和PI3K/AKT的激活，并通过调节抑制凋亡的一氧化氮合酶调节一氧化氮（NO），促进肝再生[21]。上述增殖促进物质通过配体受体结合启动信号传导通路介导肝再生的启动和增殖，最终诱导肝细胞核内的细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）与包括CyclinD1及Cyclin E等细胞周期蛋白结合形成复合物的顺序形成，控制细胞增殖的进展[19]。在肝细胞增殖的同时，肝星状细胞，库否细胞和肝内皮细胞响应于来自增殖肝细胞的信号而发生增殖，增生的肝细胞可以围绕新生成的毛细血管形成细胞团，随后在肝星形细胞分泌的层粘连蛋白帮助下形成肝索，同时毛细血管最终转化为肝窦。研究显示血管生成素-2（Ang2）在肝再生的初期被下调，但在肝再生的血管生成期上调，调控血管内皮生长因子（VEGF）发挥促血管生成作用，这一过程受到肝窦内皮细胞的调节[22]。当肝脏再生的体积达到预定比例时，再生终止的调控机制被激活。转化生长因子-β（TGF-β）是肝再生过程中最著名的肝细胞增殖抑制剂和终止信号，可以与受体结合后介导SMAD等蛋白分子磷酸化逐级传递信号，调控相关基因的表达抑制再生肝细胞中的DNA合成及细胞增殖，促进肝再生的终止。再生初期，HGF和EGF的表达导致星状细胞分泌的抗增殖因子TGF-β上调，但被再生早期下调的TGF-β受体抵消了其抗增殖作用[23]。此外，IL-6的高表达导致细胞因子信号传导抑制因子SOCS3的快速上调，SOCS3可以阻止STAT3的磷酸化，阻断IL-6信号通路，这种负反馈循环解释了IL-6的过度表达会导致肝部分切除术后肝损伤增加和细胞生长受损[24]。Hippo激酶信号级联通路通过感知肝脏体积恢复的情况，经MST1/2-LATS1/2激酶调控YAP/TAZ转录因子参与抑制细胞增殖，终止肝再生[25]；Hippo信号也可分别负调节WNT和TGF-β信号传导，对肝细胞中Hippo通路的靶点进行修饰可以导致肝细胞的过度生长和肿瘤发生倾向[26]。最近，HNF4α以及肿瘤抑制基因p53和p21等也被认为是肝再生中重要的增殖抑制剂[27-28]。

涉及肝再生的众多信号传导途径是复杂且相互关联的，单个途径的失活通过冗余信号传导机制得到补偿，导致再生过程的延迟而不是失败。然而这种机制并不是无限制的，Paranjpe S等[29]研究发现当MET和EGFR的双重抑制时可以导致LR完全阻断。再生的终止途径也并非单一的，单独阻断肝细胞中的TGF-βII受体不足以阻止再生的终止，但如果同时抑制激活素A或阻断激活素A受体，能使得细胞持续增殖[30]。

3 肝脏再生的替代途径

肝脏对各种损伤的独一无二的反应能力是神奇的，除了肝细胞介导的肝再生，肝脏再生具有广泛的细胞来源，可以认为肝脏是一个具有干细胞特征的细胞库，在特殊情况下显示出巨大的细胞可塑性。不同损伤部位、类型和持续时间和经典再生途径的失败决定了不同的招募的细胞类型和增殖部位，不同的病理条件导致了不同程度的各类实质细胞损伤，在细胞和非细胞因子之间的高度协作调节下，肝脏诱导最适宜的细胞进行再生[5]。

3.1 肝细胞和胆管细胞互为干细胞

在胚胎发生过程中，肝细胞和胆管细胞共同来源于成肝细胞的分化。最近，Schaub JR等[31]发现一部分门脉周围肝细胞可以直接转分化成为胆管细胞，这一过程与Notch信号及TGF-β有关。成熟的肝细胞在损伤后可发生去分化，可以被认为是快速增殖和再分化成新的肝细胞和胆管细胞的双能祖细胞[10]。De Jong等[32]的研究表明，胆周腺（peribiliary gland，PBG区域的细胞能够通过向正常胆管上皮细胞增殖、分化和成熟来弥补肝外胆管的胆道细胞损失，Deng等[33]通过使用双荧光报告系统的谱系示踪实验确定胆管上皮细胞在两种小鼠慢性肝损伤模型中显著促进肝细胞再生，胆管细胞直接转化为肝细胞而没有祖细胞中间体。Raven A等[34]的实验发现经过p21过表达和Itgβ1缺失导致的肝细胞增殖受损的过程中诱导了胆管细胞衍生的肝细胞的显著出现。Choi TY等[35]在斑马鱼生物模式中观察到当肝细胞大量耗竭后，选择性压力促进了胆道上皮细胞向肝细胞的显著转化。Lu WY等[36]研究发现当在小鼠中诱导＞98%的肝细胞衰老或凋亡后，来自胆道上皮细胞室的祖细胞有助于完成功能性肝重建。这些都说明成熟的胆管细胞可以直接或者通过转化为祖细胞最终完成向肝细胞的转分化。因此，我们认为成熟的肝细胞和胆管细胞都具有高复制能力和可塑性，当其独立的增殖过程受限时，两个上皮间室中的每一个都可以作为另一个兼性干细胞的来源。最近的研究发现YAP和Taz的调节帮助肝细胞和胆管上皮细胞获得可塑性，诱导去分化为具有祖细胞特征的细胞和/或肝细胞和胆管上皮细胞之间的转分化。在肝部分切除术后可以看到短暂的YAP过度激活介导肝再生而不会产生有害的副作用，但是持续的YAP信号激活会导致肿瘤的发生[37]。

3.2 肝祖细胞介导的肝再生

1957年Popper等[38]最早描述了胆管反应（ductular reaction，DR），表现为肝脏损伤诱导的小胆管的活化和反应性扩张增生。后来越来越多的研究发现DR是各种急性、慢性损伤下肝脏特征性的病理变化，而DR反应的细胞也逐渐由不规则反应性胆管细胞丰富为具有高度可变表型特征的扩增群体。目前的研究广泛认为肝祖细胞（hepatic progenitor cell，HPC）是DR反应的主体细胞，在人肝脏中，如果经典的肝细胞介导的肝再生受到严重肝损伤的限制或失败时，HPCs可以作为肝细胞的贮存器介导最主要的肝再生替代模式。HPC（在啮齿动物中称为卵圆细胞hepatic oval cells，HOC）是驻留在肝内胆管的最末端Hering管基部的双能祖细胞，静息的HPC可以在特定损伤的激活下从肝小叶的周围开始增值，扩张渗入肝索并经历细胞分化至少可分化为肝脏的两种主要上皮细胞，即肝细胞和胆管上皮细胞，最终在中央静脉附近融合尝试重新建立肝小叶实现肝再生[39-44]。

对于HPC的起源与分化的研究已经进行了很多，主要方法涉及分离培养或者细胞系谱追踪等，但由于不同激活状态下HPC的标志物不同而且可能存在物种差异，目前仍不完全清楚。HPC细胞表达胆道标志细胞角蛋白（CK7/19），但肝细胞标志物（hepPar-1，HNF4α）的表达也经常被观察到。大面积肝坏死时存活的肝细胞能够暂时“去分化”成表达甲胎蛋白，具有增殖腺泡样特征的肝细胞[45]，在长期受损的肝脏中，成熟肝细胞也被发现能够历经可逆的导管化生，再生率高达其丢失细胞数量的60%[46]。因此HPC有可能有来源于肝细胞的去分化机制。在斑马鱼模型中，BMP信号与Smad5受体结合，通过TBX2b调控由胆管上皮细胞去分化为的LPC向肝细胞分化，并通过id2a调控胆管上皮细胞增殖[47]。He J等[48]也证实当在肝细胞几乎完全丧失的斑马鱼模型中，胆管上皮细胞通过去分化为HPC最终产生肝细胞。这些证据说明除了HPC是一种特定的驻留的未分化细胞外，前述的成熟肝细胞或胆管细胞转变为相反的谱系以代替丢失的组织，这种转分化过程中的中间体也可能是HPC的来源。这提示我们可以诱导实质细胞转分化为具有再生功能的肝细胞在理论上可行，但目前尚不清楚这种再生机制在不同物种之间的差异。

对不同临床肝胆疾病中DR反应的研究发现HPC可以被认为是动态干细胞，它们根据丢失上皮细胞的类型和不同的损伤病理特征表达不同的标记物并转换分化模式，如在急/慢性病毒性肝炎、酒精性肝炎肝硬化、非酒精性脂肪性肝炎以及大规模肝切除术等肝细胞严重损伤的情况下分化为成熟肝细胞，而在原发性胆汁性肝硬化和原发性硬化性胆管炎等胆汁淤积条件下转化为成熟的胆管细胞[49]。在对决定HPC的动态潜能的机制研究中，HPC-niche这一概念得到越来越多的认可，用来描述在HPC的激活、增殖和分化过程中广泛交互作用的实质和非实质的细胞如肝细胞、胆管细胞、星状细胞、内皮细胞、巨噬细胞和其他募集的炎症细胞以及生长因子和细胞因子和细胞外基质等组分组成的独特微环境[50-51]。

除了HPC，在人类中又鉴定了另外一种胆源起源祖细胞群胆管干/祖细胞（biliary tree stem/progenitor cells，BTSCs），BTSCs是位于大型肝内和肝外胆管的胆管周围腺体内的多能干细胞，表达典型转录因子（SOX9、SOX17和PDX1）、表面分子（EPCAM、lgr5和/或cd133）和细胞质标记（CK7、CK19），BTSC可以向功能性肝细胞、成熟胆管细胞和胰腺内分泌细胞分化。与LPC类似，BTSCs对维持肝脏和胆道稳态再生的实际贡献是微不足道的，然而却广泛参与了各种慢性损伤介导的肝脏和胆道疾病后的再生反应[52-53]。然而上述机制可能因物种和病理基础而不同，我们应该批判性地看待。总之，肝脏再生的内源性细胞来源的丰富性，我们应该明确在人类不同的特定病理情况下哪些过程是活跃的，并利用机制诱导特定的分化，调控疾病的进程。

4 细胞疗法及展望

细胞治疗方法和再生医学一直是生物工程学家和外科医师尤其是肝脏移植专家关注的热点话题。随着对肝再生的广泛细胞来源的研究深入，这一命题得到了更多的发展[54]。Wu JY等[55]从原代肝细胞制备出exosome-mimetic nanovesicles（NVs），NVs能显著提高受体细胞中鞘氨醇激酶-2的含量，促进体外肝细胞增殖和体内肝再生。最近Chen HS等报道了通过使用200 g原代肝细胞的球状储库生物人工肝治疗改善85%肝切除术后急性肝衰竭的猪的存活率，并加速了肝再生[56]，但其临床安全性仍需要更多的研究。干细胞是肝再生细胞来源的重要补充，其中间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）因具有获取容易，易体外培养，免疫源性低以及无伦理道德争议等特点成为肝脏疾病细胞疗法的理想来源。Spitzhorn LS等人将胚胎干细胞来源的MSC移植到先天性高胆红素血症的大鼠模型中，MSC细胞在肝脏中存活长达2个月并能分化为功能性肝细胞，促进了肝脏再生[57]。Lin NC的研究发现MSC在移植后2周内可以通过维持急性期的肝功能稳态和降低缺血再灌注引起的活性氧（reactive oxygen species，ROS）损伤促进肝再生，并在移植后2～4周分化为功能性肝细胞来延长生存期并预防急性肝衰竭[58]。此外，许多研究报道了利用小分子物质在体外诱导MSC转分化为具有和肝细胞类似的外形及功能的肝样细胞的方案[59-60]。然而如何获得功能更全面的肝样细胞以及如何提高移植的效率仍是需要解决的问题。利用共培养模式或新型材料构成的3D支架系统以模拟体内环境成为研究的热点[61-63]。Ding HR等[64]发现MSC能够通过AKT/GSK-3β/β-catenin途径影响代谢，促进糖原合成和肝脏再生，增加了90%PH引起的急性肝衰竭大鼠模型的存活率。MSC还可以根据微环境差异释放不同的因子，产生抗凋亡，诱导肝祖细胞增殖和分化及促进血管新生等作用[65]。有证据表明这种旁分泌机制是由MSC释放的细胞外囊泡（EVs）介导的[66]。此外，MSC产生分泌参与细胞外基质重塑和趋化因子等物质，抑制T细胞和B细胞的增殖，影响树突状细胞的活化和成熟，并对非特异性免疫系统产生调节作用，从而减轻肝脏的过度炎症反应，通过免疫功能的调节来促进肝脏再生[67]。MSC的多种作用赋予了其用作细胞疗法优于药物治疗的优势，优化MSC移植的方式、扩大可供移植的细胞数目以及延长移植MSC的生存期，都对MSC治疗的疗效具有重要意义。未来，需要更多的临床实验研究以阐明MSC治疗的安全性和远期疗效[68]。

人类对肝再生这一古老又神奇的命题有很多的理解，然而我们也应该看到还有许多的挑战在我们面前。相信随着对肝再生广泛细胞来源研究的不断发展，我们定会进一步解开肝再生的未解之谜，从而为临床实际问题提供策略。