冻融移植胚胎培养第7天囊胚成功获得活产1例▲

阮秋燕 唐秀法 公方强 方伟芬 乃东红 牛向丽

(广西壮族自治区计划生育研究中心生殖医学科，南宁市 530021，电子邮箱：qiuyanruan@163.com)

囊胚培养技术是目前评估胚胎发育潜能较为普遍的一种方法，胚胎在培养第5～7天能够形成囊胚被视为具有较高的发育潜能[1]。发育缓慢被认为是胚胎发育潜能低下的标志之一，这可能是胚胎发育异常和非整倍体率高造成的，是胚胎植入失败的危险因素[2-3]。目前，大部分生殖中心(以下简称中心)常规选择移植或冷冻胚胎培养后第5～6天的囊胚，丢弃在第6天仍未形成可用囊胚的胚胎，较少有中心观察胚胎至第7天，第7天囊胚的临床应用价值还存在较大争议。本文报告1例冻融移植胚胎培养第7天囊胚获得活产的病例，旨在为胚胎发育缓慢、在第5～6天未获得可移植胚胎的病例提供参考。

1 资料资料

1.1 一般资料及病史 女方32岁，男方34岁，婚后10年未孕，因女方“盆腔炎性疾病后遗症”于2017年3月在我院行辅助生殖技术助孕。女方体重指数26.22 kg/m2，平素身体健康，月经规律，B超监测排卵提示正常，基础性激素检查正常。男方平素身体健康，无烟酒嗜好，否认腮腺炎、不洁性生活等病史。男方多次行精液常规分析结果均提示为中度弱精子症，正常形态精子比例为4%；查性激素正常，染色体核型分析为46,XY。曾于2017年3月在我院行第1周期体外受精胚胎移植术助孕，采用拮抗剂方案进行降调，获得卵丘-卵子复合物4枚，其中第二次减数分裂中期(metaphaseⅡ,MⅡ)的卵母细胞(即成熟卵母细胞)3枚；术日精子质量差，行单精子卵胞浆注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)后获得正常受精胚胎[即2个原核 (2 pronucleus,2PN)胚胎]3枚，正常卵裂胚胎3枚，优质胚胎1枚(6细胞2级胚胎，6CG2)，2枚非优质胚胎(1枚4细胞1级胚胎4CG1，1枚因质量差经医学处理后废弃)；移植新鲜第3天胚胎2枚(6CG2，4CG1)，未孕。无冷冻胚胎。

1.2 卵子采集和精液分析 2017年8月28日在我院行第2次助孕治疗，采用黄体期短效促性腺激素释放激素激动剂长方案进行降调，采用重组人促卵泡激素联合重组人绒毛膜促性腺激素进行促排卵。2017年9月22日在阴道超声引导下穿刺获取卵丘-卵子复合物12枚，其中10枚MⅡ卵子用于ICSI。男方禁欲4 d后采用手淫法获得精液用于ICSI，经过精液分析，精液体积3.5 mL，呈灰白色，浓度5×106/mL，活动率为11%，前向运动精子率为3%。

1.3 胚胎观察 ICSI后18 h观察胚胎受精情况。 2PN胚胎视为正常受精胚胎；第3天卵裂期胚胎细胞数≥6个，卵裂球大小均一、碎片比例≤20%、胞质饱满、质地均匀的胚胎为优质胚胎；第3天优质胚胎大于5枚，则进行全囊胚培养；囊胚评分采用 Gardner评分系统，发育到3BC及以上的胚胎予以移植或冷冻。患者ICSI后第1天获得10枚2PN胚胎，第3天获得9枚优质胚胎(包括10细胞2级胚胎10CG2 1枚，7细胞1级胚胎7CG1 1枚，7细胞2级胚胎7CG2 3枚，6细胞2级胚胎6CG2 4枚)和1枚非优质胚胎(4细胞2级胚胎4CG2);将全部胚胎进行囊胚培养后第5天胚胎为卵裂期样胚胎，第6天形成2枚融合期胚胎，将胚胎培养至第7天，2枚融合期胚胎发育成2枚3BC囊胚。因女方内膜未准备好，采用日本加藤玻璃化冷冻复苏试剂及载体(Kitazato公司，试剂编号为 VT101 /102 ，载体为CryoTop)对胚胎进行冷冻，按照说明书严格操作。

1.4 解冻移植 月经周期第4天开始采用B超监测内膜，口服戊酸雌二醇片(广州先灵药业有限公司，批号：B14202007142)1.5 mg/次，2次/d，8 d后增至6 mg/d；第15天开始口服地屈孕酮(荷兰Abbott Healthcare Products B.V.，批号：C14202012256)20 mg/次，3次/d进行内膜转化，内膜转化第6天，即2018年5月22日，进行解冻胚胎移植。采用日本加藤玻璃化冷冻复苏试剂及载体进行胚胎复苏，按照说明书严格操作。解冻完成后对囊胚进行辅助孵化，短暂培养后进行移植。共解冻2枚第7天囊胚，均成活，短暂培养后囊胚长势良好，移植时均成功扩张孵出(5BC)，移植过程顺利。移植后按上述剂量持续使用戊酸雌二醇片和地屈孕酮，2周后查血人绒毛膜促性腺激素水平为1 663 mIU/mL，并继续支持持续妊娠到第10周；在28 d后采用B超检测孕囊和胎心，监测到2个孕囊，内见胎芽、卵黄囊及原始心血管搏动，获得双胎妊娠。孕36+2周行剖宫产获得活产一男婴(2.8 kg)和一女婴(2.3 kg)，出生后10 min Apgar评分10分，外观无异常。

2 讨 论

目前，有学者通过Time-lapse培养系统观察胚胎发育动力学参数并结合妊娠结局发现，胚胎在受精后卵裂到8细胞的时间(t 8)能较好预测胚胎种植结局[4]，其中t 8>68 h是胚胎植入失败的危险因素[5]。本例患者第1周期ICSI后仅获得3枚正常受精胚胎，其中有1枚优质胚胎(6CG2)；第2周期ICSI第3天获得9枚优质胚胎，但仅有1枚胚胎大于8细胞。由此提示该患者整体胚胎发育较慢，胚胎发育速度异常与子宫植入窗不吻合可能是患者多年不孕的原因。

据统计，约67%的囊胚在胚胎培养后第5～6天形成，约29%的囊胚在第7天形成[2]；第5、6、7天囊胚的可用囊胚率分别为65%、30%、5%[6]。约3%的患者仅在培养第7天形成可用囊胚[6]，移植后能够获得16.6%～31.7%的临床妊娠率和25%的活产率，与第6天囊胚的临床结局相似，但显著低于第6天囊胚[1-2,7-8]。Utsunomiya等[9]报告第7天囊胚的临床妊娠率小于10%；而Whitney等[10]报告第7天囊胚流产率高于第5天囊胚，活产率低于第5天囊胚。而非整倍体率高可能是造成第7天囊胚临床妊娠率低、流产率高(与在第5～6天囊胚相比)的重要原因。植入前胚胎遗传学非整倍体检测(preimplantation genetic testing for aneuploidy,PGT-A)是目前检测早期胚胎非整倍体的有效方法之一，能有效降低非整倍体移植率而提高胚胎植入率，并减少异常胚胎植入给患者带来的痛苦[11-12]。Hernandez-Nieto等[13]通过PGT-A分析不同天数囊胚，发现胚胎非整倍体率随着形成囊胚天数的增加而增加，并发现整倍体单胚胎解冻移植临床妊娠率随着培养天数增加而显著下降，这可能是第7天囊胚质量差造成的。

本例患者第2周期助孕治疗时，将全部胚胎进行囊胚培养后，第5天胚胎呈卵裂期样，第6天形成2枚融合期胚胎，培养至第7天才形成2枚3BC囊胚，进行胚胎冷冻，女方内膜准备好后，经胚胎复苏，顺利移植，最终成功获双胎妊娠，母婴结局均良好。但是目前，第7天囊胚发育迟缓、胚胎质量差和非整倍体率高使其临床应用的可行性和安全性存在较大争议[7]。对于该部分患者，在第3、5、6天没有获得可移植胚胎，未见明显细胞退化的情况下，将胚胎延长培养至第7天可能是一种无奈的选择，若形成可用囊胚建议结合PGT-A技术，移植整倍体囊胚可以改善妊娠结局，在一定程度上减少患者精神上和经济上的压力，减少患者多次刺激卵巢进行取卵的痛苦，提高累计妊娠率。寻找患者因素、优化培养条件、改善发育迟缓胚胎的发育速度和胚胎质量，可能是进一步的研究方向。

总之，由于目前第7天囊胚移植报道较少，第7天囊胚占总移植胚胎比例小，其应用价值和安全性需要长期随访以及跟踪后代健康来证实。